趙 莉，盧 凱，王小紅，劉 睿*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

熱加工能賦予食品誘人的風(fēng)味和色澤，是一種重要的食品加工技術(shù)，但隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新生有害物質(zhì)在熱加工食品中被檢測(cè)出來，主要有丙烯酰胺、呋喃、羥甲基糠醛[1]、多環(huán)芳烴和雜環(huán)胺。研究表明油炸薯?xiàng)l、薯片等富含淀粉質(zhì)碳水化合物的高溫加工食物中含有高含量的丙烯酰胺[1]，因其具有致畸性、致癌性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性和生殖毒性而引起人們對(duì)熱加工食品中包括丙烯酰胺在內(nèi)的新生污染物的高度關(guān)注[2-3]。而如何篩選到高效的丙烯酰胺抑制劑添加到食品加工中從而減少食品熱加工過程中丙烯酰胺的產(chǎn)生一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

已有研究表明，酸化劑、氨基酸和蛋白質(zhì)均可作為丙烯酰胺抑制劑[4]。檸檬酸在土豆和谷物食品體系中對(duì)丙烯酰胺的抑制率為23%[5]，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺可以使天冬酰胺-葡萄糖模型中丙烯酰胺含量降低57%[6]。近年來，包括原花青素在內(nèi)的天然產(chǎn)物對(duì)丙烯酰胺抑制作用的研究被廣泛報(bào)道，如綠茶、肉桂、牛至等提取物能顯著抑制油炸土豆片中丙烯酰胺的產(chǎn)生[7-8]，香豆酸也具有類似的效果[9]。作為植物多酚中典型代表之一，黃烷醇及其衍生物對(duì)丙烯酰胺的抑制效果明顯優(yōu)于黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷醇及其衍生物[10]。研究也證實(shí)兒茶素、表兒茶素這些黃烷醇類化合物抑制丙烯酰胺產(chǎn)生的效果優(yōu)于槲皮素、沒食子酸等[11]，這表明黃烷醇類多酚——原花青素可能是一種更值得關(guān)注的丙烯酰胺抑制劑。已有研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素在化學(xué)模擬體系中能顯著抑制丙烯酰胺的形成并且在添加量為0.5%時(shí)，抑制率可達(dá)58.4%[12]；蘋果原花青素粗提物在低濃度條件下對(duì)丙烯酰胺有明顯抑制作用[13]；蓮原花青素提取物在添加質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL、荔枝原花青素提取物在添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，丙烯酰胺的生成量均顯著減少[14]；花生紅衣原花青素（peanut skin procyanidins，PSP）在化學(xué)模擬體系和食品體系中對(duì)丙烯酰胺均有良好的抑制效果[15]。然而上述有關(guān)原花青素抑制丙烯酰胺效果的研究主要是以原花青素粗提物或混合物為研究材料而展開，重點(diǎn)關(guān)注單一的低聚體原花青素對(duì)丙烯酰胺抑制效果卻鮮有報(bào)道。

花生在中國(guó)是一種重要的油料作物，種植廣泛，其種皮即花生紅衣中含有豐富的原花青素，且以A型原花青素為主[16]，但是利用率很低[17]。因此本研究以花生紅衣為原料，制備并鑒定其中一種原花青素的結(jié)構(gòu)，并探究該原花青素在天冬酰胺-葡萄糖化學(xué)模擬體系和炸薯?xiàng)l食品體系中對(duì)丙烯酰胺生成的抑制效果，以期為提高花生紅衣的利用率以及開發(fā)一種高效抑制食品熱加工過程中丙烯酰胺產(chǎn)生的食品添加劑提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生產(chǎn)于遼寧地區(qū)，品種為白沙；速凍薯?xiàng)l 山東綠潤(rùn)食品有限公司；花生油 山東魯花集團(tuán)有限公司。

原花青素A1（≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；丙烯酰胺（≥99%） 美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；甲醇、乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；L-天冬酰胺一水合物（純度99%）上海麥克林生化科技有限公司；D（+）-無水葡萄糖、甲醇、甲酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正己烷（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AL 204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YZ-1531-8友田多功能油炸鍋 廣東容聲電器股份有限公司；2695型高效液相色譜儀、Oasis HLB（200 mg，30 μm） 美國(guó)Waters公司；Hypercarb色譜柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）、Hypercarb保護(hù)柱（10 mm×2 mm） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；核磁共振光譜儀（600 MHz） 德國(guó)Bruker儀器公司；Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 μm） 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 花生紅衣中原花青素單體的分離制備

參考陳洋[18]的方法，以花生紅衣為原料，采用70%乙醇溶液進(jìn)行熱提取90 min，通過AB-8大孔樹脂以40%乙醇溶液進(jìn)行純化得到高純度的原花青素混合物粉末，然后將粉末通過Toyopearl HW-40（S）凝膠色譜柱進(jìn)行分離，得到用于分離原花青素純品的目標(biāo)級(jí)分記為PSP-4。采用制備型高效液相色譜分離PSP-4得到目標(biāo)原花青素純品記為PSP-4-1。

反相-高效液相色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.13%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速3 mL/min；進(jìn)樣量1 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；梯度洗脫：0 min，15% B；15 min，15% B；30 min，45% B；35 min，15% B。

1.3.2 PSP-4-1的液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜及核磁分析

用甲醇分別配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的目標(biāo)原花青素純品和原花青素A1對(duì)照品，分別通過0.22 μm濾膜過濾得到樣液，待進(jìn)樣分析。

液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜條件：Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.13%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25 ℃；梯度洗脫：0 min，15% B；15 min，15% B；30 min，45% B；5 min，15% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速8 L/min；噴霧壓力45 psi；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～900。

一維核磁共振采用Bruker Avance III HD 600 MHz核磁共振儀鑒定，氘代甲醇作溶劑。

1.3.3 丙烯酰胺的高效液相色譜測(cè)定

參考周婷[15]的分析方法。Hypercarb色譜柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；Hypercarb保護(hù)柱（10 mm×2 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；流速0.6 mL/min；流動(dòng)相為超純水；運(yùn)行時(shí)間20 min。

1.3.4 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用稀釋法分別用超純水配制成0.5、1.0、5、10、20、30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，采用1.3.3節(jié)方法，進(jìn)行高效液相色譜分析。以丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=131 935x+35 560（R2=0.999 9），線性范圍在0.5～30 μg/mL之間。

1.3.5 模擬化學(xué)體系中丙烯酰胺抑制效果測(cè)定

參考周婷[15]的方法。稱一定量的天冬酰胺與葡萄糖，溶解在超純水中，制成丙烯酰胺反應(yīng)液。用超純水將原花青素A1配制成質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL的溶液。移取1.0 mL反應(yīng)液加入10 mL耐高溫的螺口試管中，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL已配制好的不同質(zhì)量濃度的原花青素A1溶液，空白對(duì)照添加超純水。180 ℃油浴加熱30 min，反應(yīng)后加入超純水定容至3 mL。取1.5 mL反應(yīng)樣液于離心管中，分別加入carrez I和carrez II，混勻；5 000 r/min離心15 min。吸取上清液通過固相萃取柱，加入3 mL超純水洗脫，收集洗脫液過0.22 μm濾膜，通過1.3.3節(jié)建立的高效液相色譜法進(jìn)行分析。通過1.3.4節(jié)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算丙烯酰胺含量，并按下式計(jì)算原花青素A1對(duì)丙烯酰胺的抑制率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。

式中：M0為空白對(duì)照組中丙烯酰胺質(zhì)量/μg；Mn為實(shí)驗(yàn)組中丙烯酰胺質(zhì)量/μg。

1.3.6 炸薯?xiàng)l食品體系中丙烯酰胺抑制效果測(cè)定

參考Qi Yajing等[19]方法，并稍作修改。溫水洗去薯?xiàng)l上的油脂，瀝干。采用超純水分別配制0.01、0.03、0.1、0.3 mg/mL的原花青素A1浸漬液，將薯?xiàng)l浸漬在不同質(zhì)量濃度原花青素A1浸漬液中15 min，為實(shí)驗(yàn)組；空白組浸漬在水溶液中；取出后將多余水分用濾紙擦干。薯?xiàng)l在175 ℃油炸6 min后，瀝干薯?xiàng)l殘余油分，并冷卻。稱取15 g炸薯?xiàng)l樣品粉碎，用正己烷脫脂30 min，棄去油層；重復(fù)脫脂1 次。樣品脫脂后，加入100 mL超純水超聲提取30 min；重復(fù)2 次，合并提取液。提取液在5 000 r/min離心20 min后，棄去正己烷層；再次向離心管中加入carrez I和carrez II，混勻；5 000 r/min離心20 min以沉淀蛋白。吸取處理后的提取液990 μL，并加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的丙烯酰胺10 μL，通過固相萃取柱，加入3 mL超純水洗脫，收集洗脫液過0.22 μm濾膜，通過1.3.3節(jié)建立的高效液相色譜法進(jìn)行分析。計(jì)算同1.3.5節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件和Origin 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以表示，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSP-4-1的液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

圖1 以原花青素A1（a）為對(duì)照的PSP-4-1（b）的液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析色譜圖Fig. 1 Q-TOF-LC/MS chromatogram of procyanidin A1 (a) and PSP-4-1 (b)

如圖1所示，PSP-4-1的保留時(shí)間為10.6 min，與原花青素A1的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)。對(duì)圖1中原花青素A1和PSP-4-1進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 原花青素A1（a）和PSP-4-1（b）的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass and MS2 chromatogram of procyanidin A1 (a) and PSP-4-1 (b)

由圖2b1可以看出，負(fù)離子模式下，在保留時(shí)間為10.6 min時(shí)出現(xiàn)m/z 575.117 8的準(zhǔn)分子離子峰，其是原花青素組成單元（兒茶素和/或表兒茶素）由C4～C8或者C4～C6相連并在C2和C7或C2與C5之間形成C—O—C鍵的原花青素二聚體（即A型原花青素）在電噴霧離子源負(fù)離子模式下失去1個(gè)H而形成的分子離子質(zhì)荷比，相對(duì)分子質(zhì)量為576.117 8，分子式為C30H24O12。A型聚合體原花青素常發(fā)生RDA（Retro-Diels-Alder）裂解，即原花青素的C環(huán)，失去1個(gè)中性的C8H8O3，因此出現(xiàn)了m/z 423.072 6碎片[20]。A型二聚體可能會(huì)發(fā)生聚合，m/z 863.678 9是兩分子A型二聚體聚合后，在負(fù)離子模式下，失去1個(gè)H并發(fā)生quinone methide fission (QM) cleavage分子間斷裂（m/z減少290）產(chǎn)生的[21]。由圖2b2可知，PSP-4-1的二級(jí)碎片離子分別為m/z 539.099 0、407.078 1、285.040 8，其中m/z 539.099 0是分子離子脫去兩分子的H2O（m/z減少36）產(chǎn)生的，m/z 407.078 1是分子離子發(fā)生RDA裂解（m/z減少152）同時(shí)再脫去一分子的H2O產(chǎn)生的，m/z 285.040 8是分子離子發(fā)生quinone methide fi ssion (QM) cleavage分子間斷裂（m/z減少290）產(chǎn)生的。PSP-4-1中的分子離子斷裂及碎片符合A型原花青素二聚體裂解規(guī)律[22-23]。綜上，可以推斷制備后得到的PSP-4-1為A型原花青素二聚體。且與圖2a對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其與原花青素A1的裂解信息基本一致，由此可初步推斷制備得到的PSP-4-1可能為原花青素A1。但由于原花青素的同分異構(gòu)體種類很多，因此通過核磁共振進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)。

2.2 PSP-4-1核磁鑒定結(jié)構(gòu)

表1 化合物PSP-4-1的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)Table 1 1H and 13C NMR data of PSP-4-1 (methanol-d4)

如表1所示，1H NMR氫譜數(shù)據(jù)顯示δ 2.57（1H，dd，J=16.44 Hz，J=8.22 Hz），2.94（1H，dd，J=16.44 Hz，J=5.58 Hz）為典型的原花青素H4信號(hào)，并且將PSP-4-1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[20,24-25]對(duì)比，確定PSP-4-1為原花青素A1，其具體結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 原花青素A1結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structure of procyanidin A1

2.3 原花青素A1在天冬酰胺-葡萄糖化學(xué)體系中對(duì)丙烯酰胺的抑制效果

從圖4可以看出，在天冬酰胺-葡萄糖化學(xué)體系中，原花青素A1對(duì)丙烯酰胺的生成有一定的抑制作用，這與Qi Yajing等[19]報(bào)道的結(jié)果一致。并且結(jié)果顯示丙烯酰胺抑制率與原花青素A1存在一定的質(zhì)量濃度效應(yīng)關(guān)系，在0.001～0.05 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，抑制率增加；并且當(dāng)質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL時(shí)，原花青素A1對(duì)丙烯酰胺的抑制率達(dá)到最大，為（58.10±3.86）%；但當(dāng)在0.05～0.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)時(shí)，抑制率在逐漸下降。

圖4 化學(xué)體系中丙烯酰胺的抑制率與原花青素A1添加質(zhì)量濃度之間的關(guān)系Fig. 4 Relationship between inhibition percentage of acrylamide formation and procyanidin A1 concentration in chemical model system (n = 4)

在化學(xué)體系中多酚類化合物可能與羰基和二羰基反應(yīng)從而抑制丙烯酰胺的形成，如表兒茶素能與化學(xué)模擬體系中還原糖的C2、C3、C4直接反應(yīng)，即表兒茶素A環(huán)上的C6、C8通過親電芳香取代與活性羰基形成共價(jià)鍵，從而抑制丙烯酰胺產(chǎn)生[26]。柚皮素結(jié)構(gòu)中A環(huán)上的C6、C8與3-氧丙酰胺醛基結(jié)合，減少3-氨基丙酰胺（丙烯酰胺生成過程中重要的前體物質(zhì)）的產(chǎn)生，從而抑制丙烯酰胺的形成[27]。原花青素在化學(xué)體系中可以顯著抑制丙烯酰胺的形成，其抑制機(jī)制可能也與此相關(guān)。但關(guān)于原花青素抑制丙烯酰胺的作用機(jī)制現(xiàn)在尚未闡明，還需進(jìn)一步研究。

2.4 原花青素A1在炸薯?xiàng)l食品體系中對(duì)丙烯酰胺的抑制效果

圖5 食品體系中丙烯酰胺的抑制率與原花青素A1添加質(zhì)量濃度之間的關(guān)系Fig. 5 Relationship between inhibition percentage of acrylamide formation and procyanidin A1 concentration in French fries (n = 4)

從圖5可以看出，在食品體系中，丙烯酰胺抑制率與原花青素A1也存在一定的質(zhì)量濃度效應(yīng)關(guān)系，在0.01～0.3 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加抑制率增加并達(dá)到最大值，當(dāng)濃度進(jìn)一步增大時(shí)，抑制率逐漸下降。并且當(dāng)質(zhì)量濃度在0.03 mg/mL時(shí)，原花青素A1對(duì)丙烯酰胺的抑制率達(dá)到最大，為（57.16±2.61）%，此質(zhì)量濃度條件下對(duì)丙烯酰胺的抑制率與其他質(zhì)量濃度條件下的抑制率比較，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在化學(xué)體系中，P S P-4質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL時(shí)對(duì)丙烯酰胺抑制效果最佳，為（42.06±1.02）%[15]，而在本研究中，PSP-4-1即原花青素A1在0.05 mg/mL時(shí)已達(dá)到最大抑制率（58.10±3.86）%。同樣地，在食品體系中，PSP-4質(zhì)量濃度也在0.5 mg/mL時(shí)對(duì)丙烯酰胺抑制效果最佳，為（46.13±1.56）%，而原花青素A1在0.03 mg/mL已達(dá)到最佳抑制率（57.16±2.61）%。即無論是在化學(xué)體系下，還是在食品體系下，原花青素A1對(duì)丙烯酰胺的抑制效果達(dá)到最佳時(shí)的質(zhì)量濃度低于混合物PSP-4，但其最大抑制率卻高于混合物PSP-4對(duì)丙烯酰胺的最大抑制率。這一結(jié)果說明經(jīng)純化分離得到的原花青素A1對(duì)于丙烯酰胺的抑制效果優(yōu)于混合物，這對(duì)于開發(fā)高效的丙烯酰胺抑制劑及開發(fā)原花青素A1具有積極意義。

在食品體系中，油脂氧化能產(chǎn)生大量的丙烯醛，丙烯醛氧化形成丙烯酸可以與氨反應(yīng)產(chǎn)生丙烯酰胺，而研究表明多酚，包括原花青素可以作為油脂氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的斷裂劑[28]，可能會(huì)抑制油脂氧化產(chǎn)生丙烯醛，從而抑制丙烯酰胺的產(chǎn)生。由此可以推測(cè)原花青素A1抑制食品體系中丙烯酰胺的形成可能與其抑制油脂氧化有關(guān)。

大量研究表明多酚的濃度與其對(duì)丙烯酰胺的抑制效果間存在非線性量效關(guān)系，如竹葉抗氧化物在較低濃度條件下，對(duì)丙烯酰胺呈現(xiàn)正相關(guān)，而在較高濃度條件下，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[29]。蘋果原花青素在低濃度條件下對(duì)丙烯酰胺抑制效果明顯高于高濃度蘋果原花青素抑制效果[13]。Budryn等[30]探究綠咖啡提取物（主要成分是黃酮和酚酸）對(duì)食品體系中丙烯酰胺產(chǎn)生的影響效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度的綠咖啡提取物抑制丙烯酰胺的形成，而在高濃度時(shí)卻促進(jìn)丙烯酰胺的形成。Qi Yajing等[19]研究發(fā)現(xiàn)不同聚合度的原花青素在食品體系中對(duì)丙烯酰胺的抑制效果均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。而在本研究中，不管是化學(xué)模擬體還是食品體系也得到了類似的結(jié)果。這可能是由于丙烯酰胺的形成和消除是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，在加熱過程中，氧自由基可能誘導(dǎo)丙烯酰胺發(fā)生聚合，而多酚由于其結(jié)構(gòu)中的酚羥基具有清除氧自由基的能力，影響了丙烯酰胺的聚合，導(dǎo)致部分多酚在較高濃度時(shí)對(duì)丙烯酰胺抑制效果下降的原因。

3 結(jié) 論

本研究以花生紅衣為原料，采用凝膠色譜分離并結(jié)合反相高效液相色譜分離制備得到一種原花青素，通過與對(duì)照品比較、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析及核磁共振技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)為表兒茶素-（2β→O→7,4β→8）-兒茶素（原花青素A1）。

研究原花青素A1在化學(xué)模擬體系及炸薯?xiàng)l食品體系中對(duì)丙烯酰胺生成的影響，原花青素A1在2 種體系中對(duì)丙烯酰胺的形成均有抑制作用，并且在實(shí)驗(yàn)選定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，原花青素A1對(duì)丙烯酰胺的抑制均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在化學(xué)模擬體系中，當(dāng)原花青素A1的質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL時(shí)，對(duì)丙烯酰胺的抑制率達(dá)到最大，為（58.10±3.86）%；食品體系中，其質(zhì)量濃度在0.03 mg/mL時(shí)，對(duì)丙烯酰胺的抑制率達(dá)到最大，為（57.16±2.61）%。這一研究對(duì)于開發(fā)一種高效、經(jīng)濟(jì)的丙烯酰胺抑制劑具有指導(dǎo)意義。