寧亞維，劉 茁，范素芳，馬俊美，李 強(qiáng),*，張 巖,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000）

食物過敏大多是食物中過敏原蛋白對(duì)機(jī)體細(xì)胞的選擇性刺激，從而引起機(jī)體免疫系統(tǒng)異常和生理機(jī)能障礙[1-2]，近年來已經(jīng)成為國(guó)際關(guān)注的重大食品安全問題，其危害僅次于食源性微生物污染[3]，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是21世紀(jì)的流行病[4]。

在食物過敏中，90%以上是由含麩質(zhì)的谷物、甲殼類、魚類、蛋類、花生、大豆、乳和堅(jiān)果及其制品8 種食物引起的[1]，其中雞蛋過敏的人群最為廣泛，特別是3歲以下的兒童為雞蛋過敏的易發(fā)人群[5]。目前，對(duì)于雞蛋過敏尚無有效的治療手段，過敏人群只能嚴(yán)格控制日常飲食不得含有過敏原，然而雞蛋營(yíng)養(yǎng)豐富，在眾多食品中均有添加，過敏人群難免會(huì)受到傷害[2]。對(duì)此，國(guó)外已經(jīng)出臺(tái)了強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)食品過敏原的法規(guī)[6]，而國(guó)內(nèi)只有針對(duì)出口食品過敏源成分的標(biāo)準(zhǔn)，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法為主，需要開發(fā)制定高靈敏度的直接對(duì)常見致敏蛋白的定性定量方法，并制定相應(yīng)的標(biāo)識(shí)法規(guī)。

目前用于過敏原檢測(cè)的手段主要有酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法[7-11]、PCR法[12-15]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[16-17]。ELISA法是基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)，是現(xiàn)在最為成熟的方法，但是由于各種加工手段使蛋白質(zhì)存在不同程度的變性，導(dǎo)致無法與抗體準(zhǔn)確結(jié)合，而且ELISA法不可避免存在交叉反應(yīng)且通量低，因此不適于對(duì)雞蛋過敏原的準(zhǔn)確定量[1,3]。PCR法是基于DNA水平的檢測(cè)手段，而非直接對(duì)致敏蛋白進(jìn)行定量，但雞蛋含有極少量的DNA，并且雞蛋和雞肉中的DNA沒有差異性[3,12]。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法廣受關(guān)注，其基于特征肽段有效地解決了變性蛋白的定量檢測(cè)問題，而且可以直接對(duì)蛋清致敏蛋白進(jìn)行高靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度的檢測(cè)。此方面，Tolin等[18-19]通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以卵白蛋白和溶菌酶作為主要致敏蛋白來表征葡萄酒中雞蛋源澄清劑的存在，同時(shí)與酶聯(lián)免疫點(diǎn)印跡化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行比較，檢出限降低了10 倍，可以實(shí)際應(yīng)用于商業(yè)葡萄酒中微量動(dòng)物源澄清劑的殘留檢測(cè)；Heick等[20]采用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定面包基質(zhì)中的卵白蛋白，檢出限為42 μg/g，且線性范圍廣；Planque等[21-22]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測(cè)定巧克力、冰淇淋、番茄醬和餅干中的卵白蛋白，檢出限達(dá)到3.4 μg/g。

鑒于質(zhì)譜檢測(cè)方法具有高靈敏度與特異性的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)擬通過UPLC-MS/MS技術(shù)建立雞蛋過敏原卵白蛋白的定量檢測(cè)方法，并進(jìn)行線性關(guān)系、檢出限、加標(biāo)回收等方法學(xué)驗(yàn)證，將所建方法應(yīng)用于實(shí)際商品中卵白蛋白的定量檢測(cè)，以期對(duì)食品中雞蛋過敏原的準(zhǔn)確定量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，配料中分別含有雞蛋和不含雞蛋的餅干、掛面、蛋糕、面包 市售。

碳酸氫銨、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、卵白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，來源于雞蛋清）、甲酸（色譜純）美國(guó)Sigma公司；乙腈、正己烷（均為色譜純）美國(guó)Fisher Scientific公司；胰蛋白酶 美國(guó)AB SCIEX公司；Watsons蒸餾水（實(shí)驗(yàn)用水） 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；蛋清過敏源卵白蛋白3 條特征肽段LTEWTSSNVMEER（LR-13）、GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）、ELINSWVESQTNGIIR（ER-16）（純度均不小于95%）由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾離心管（0.5 mL，10 kDa）、Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（配Nanospray Flex離子源） 美國(guó)Thermo Scientific公司；低蛋白吸附樣品瓶 美國(guó)Waters公司；Triple Quad 6500+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電噴霧離子源及MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)AB SCIEX公司；N-EVAPTM111氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；C18色譜柱（100 μm×4 cm，120 ?，5 μm）、C18毛細(xì)色譜柱（75 μm×15 cm，120 ?，5 μm） 北京樂潤(rùn)峰科技有限公司；Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm） 日本Shiseido公司。

1.3 方法

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱取LTEWTSSNVMEER（LR-13）、G G L E P I N F Q T A A D Q A R（G R-1 6）、ELINSWVESQTNGIIR（ER-16）各1 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成100 μg/mL的特征肽段混標(biāo)儲(chǔ)備液。精密稱取20 mg卵白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（來源于雞蛋清）于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2 mg/mL的卵白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.3.2 Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定條件

色譜條件：富集柱：C18色譜柱（100 μm×4 cm，1 2 0 ?，5 μ m）；分析柱：C18毛細(xì)色譜柱（75 μm×15 cm，120 ?，5 μm）；流速300 nL/min；進(jìn)樣體積2 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫程序：0～3 min，3%～7% B；3～38 min，7%～22% B；38～48 min， 22%～35% B；48～50 min，35%～90% B；50～60 min，90% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；掃描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000；AGC target為1×106；質(zhì)量掃描范圍m/z 350～1 800；dd-MS2分辨率17 500，AGC target為1×105；隔離窗口為m/z 2.0；Fixed fi rst mass為m/z 120.0；碰撞能為27 eV。

1.3.3 Triple Quad 6500+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定條件

色譜條件：Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫程序：0～0.5 min，2% B；0.5～4.5 min，2%～50% B；4.5～7.5 min，50%～75% B；7.5～9 min，75% B；9～9.01 min；75%～2% B；9.01～11 min，2% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子化電壓5 500 V；霧化器壓力（GS1）50 psi；輔助氣壓力（GS2）55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度500 ℃。

1.3.4 樣品預(yù)處理

食品基質(zhì)分析前需要進(jìn)行脫脂處理。稱取1 g至15 mL離心管中，加入5 mL正己烷后振蕩10 min后，9 500×g離心10 min棄去上清液；然后重復(fù)上述正己烷脫脂后，采用氮?dú)獯蹈?，以備后續(xù)處理。

1.3.5 蛋白酶水解

稱取0.1 g脫脂樣品，用超純水稀釋至10 mL，取50 μL樣品稀釋液加入690 μL水混勻，再向其中加入10 μL的DTT（100 mmol/L）于70 ℃水浴反應(yīng)30 min，然后加入10 μL的IAA（300 mmol/L）于室溫避光靜置30 min。向上述混合液中加入200 μL NH4HCO3（500 mmol/L）和30 μL胰蛋白酶（1 mg/mL）混勻，于37 ℃水浴振蕩酶解3 h，最后加入10 μL甲酸混勻以終止反應(yīng)。酶解液13 000×g離心10 min，取500 μL上清液于10 kDa超濾離心管中，14 000×g離心20 min，去除雜蛋白，收集上清液待測(cè)。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)

將配料不含雞蛋的餅干、掛面、蛋糕、面包作為空白基質(zhì)，精密移取一定量的特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）儲(chǔ)備液，分別用水和空白基質(zhì)提取液稀釋配制成2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。基質(zhì)效應(yīng)按下式計(jì)算：

式中：slopematrix為空白基質(zhì)曲線的斜率；slopestandard為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.7 加標(biāo)回收率

向空白樣品中添加卵白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液進(jìn)行回收率測(cè)定，其中卵白蛋白的具體添加量按照特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）的2、10、20 倍定量限3 個(gè)水平計(jì)算得出（卵白蛋白與GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）的物質(zhì)的量比為1）。為排除基質(zhì)對(duì)卵白蛋白定量產(chǎn)生的影響，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線均采用每種樣品對(duì)應(yīng)的空白樣品基質(zhì)提取液進(jìn)行配制。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽段的篩選

雞蛋中蛋白質(zhì)豐富，蛋清中卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶被公認(rèn)為主要的致敏蛋白[23]。卵類黏蛋白熱穩(wěn)定性較高，對(duì)胰蛋白酶有抑制作用，不易達(dá)到肽段水平的分析檢測(cè)；卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶對(duì)熱不穩(wěn)定易變性，目前研究較少。而卵白蛋白在蛋清中含量最高，由386 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為44 287 Da，主要引起免疫球蛋白IgE介導(dǎo)型過敏反應(yīng)，且不耐酶解，研究最為廣泛[23-25]。因此，雞蛋中卵白蛋白的定性定量分析成為雞蛋過敏原檢測(cè)的主要依據(jù)[18-22,26]。

特征肽段的篩選可為方法的建立提供定量依據(jù)，因此本研究首先篩選卵白蛋白中的特征肽段。將前處理后的樣品直接注入Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分離分析，將所得的肽段信息利用ProteinPilot軟件和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)分析處理。與Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果比對(duì)后，得到多條肽段。然后根據(jù)如下特征肽段的篩選原則進(jìn)行特征肽段的篩選：以7～20 個(gè)氨基酸為宜；不含錯(cuò)切或漏切的酶切位點(diǎn)；最好不含甲硫氨酸；具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)；進(jìn)行定性定量分析時(shí)，具有較好的靈敏度和峰形[20,27-30]。最終篩選到3 段響應(yīng)值較好、靈敏度較高的特征肽段，分別為L(zhǎng)TEWTSSNVMEER（LR-13）、GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）、ELINSWVESQTNGIIR（ER-16）。所選擇的3 條肽段通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，確定肽段的唯一性。參考Zhang Jingyun等[31]的方法，合成上述3條特征肽段的純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 流動(dòng)相及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸溶液2 種流動(dòng)相體系在相同的洗脫程序條件下特征肽段的響應(yīng)和出峰情況。結(jié)果表明，使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，特征肽段的響應(yīng)和峰形都要優(yōu)于前者，拖尾現(xiàn)象明顯改善，穩(wěn)定性也有所提高。在電噴霧離子源正離子模式下，加入甲酸有助于肽類物質(zhì)離子化進(jìn)而提高分離效率和質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

將3 段特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品分別用水稀釋至5 000 ng/mL，通過蠕動(dòng)泵以5 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500+質(zhì)譜儀中，以全掃描模式確定特征肽段的準(zhǔn)確母離子質(zhì)量數(shù)。3 條肽段均以[M+2H]2+作為母離子，分別再對(duì)3 個(gè)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描，確定各自的定性和定量離子。每個(gè)肽段選取3 個(gè)子離子，對(duì)子離子的破碎電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化如表1、圖1所示。

表1 過敏原卵白蛋白的合成特征肽段的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1 MRM parameters of synthetic characteristic peptides of allergen ovalbumin

圖1 卵白蛋白3 條特征肽的色譜圖（5 000 ng/mL）Fig. 1 Chromatogram of three characteristic peptides of ovalbumin (5 000 ng/mL)

2.3 方法的線性關(guān)系、LOD和LOQ結(jié)果

分別精密移取混標(biāo)儲(chǔ)備液，用水稀釋配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以3 條特征肽段的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）做線性回歸方程，并計(jì)算該方法的線性范圍。

在不含雞蛋的空白基質(zhì)中，添加混標(biāo)儲(chǔ)備液，獲得每個(gè)肽段RSN為3時(shí)，作為該肽段的檢出限（limit of detection，LOD）；每個(gè)肽段RSN為10時(shí)，作為該肽段的定量限（limit of quantity，LOQ）。由表2可以看出，在所篩選的3 條特征肽段中GGLEPINFQTAADQAR（G R-1 6）的靈敏度最高且圖1表明其響應(yīng)值最好，故選取GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）作為定量肽段，其余2 條肽段用以輔助定性分析。

表2 卵白蛋白中特征肽段的線性關(guān)系、LOD和LOQ（n=6）Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of characteristic peptides of allergen ovalbumin (n= 6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

圖2 溶劑與空白基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curves with water and six blank solvents

檢測(cè)6 種空白基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。基質(zhì)效應(yīng)大于100%時(shí)，表明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物離子化有增益作用；基質(zhì)效應(yīng)小于100%時(shí)，表明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物離子化有抑制作用。結(jié)果表明，餅干（95.05%）、面包（90.68%）、掛面（88.53%）對(duì)特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）有不同程度的減弱作用，其中掛面的離子化抑制程度最大；而蛋糕基質(zhì)（112.60%）對(duì)特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）有增益作用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)配標(biāo)來定量以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

表3 基質(zhì)中卵白蛋白的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of ovalbumin in different matrices (n= 6)

如表3所示，卵白蛋白中定量肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）在基質(zhì)餅干1中回收率在83.32%～95.66%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不大于9.97%；在基質(zhì)餅干2中回收率在80.76%～98.55%之間，RSD不大于8.59%；在基質(zhì)掛面中回收率在77.22%～92.68%之間，RSD不大于5.13%；在基質(zhì)蛋糕1中回收率在82.47%～86.56%之間，RSD不大于4.88%；在基質(zhì)蛋糕2中回收率在79.41%～82.58%之間，RSD不大于8.31%；在基質(zhì)面包中回收率在85.13%～91.36%之間，RSD不大于6.30%。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

采用市售餅干、蛋糕、面包、掛面（配料表含雞蛋）作為實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。分別采用4 種樣品的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表4。

表4 UPLC-MS/MS檢測(cè)市售食品中卵白蛋白含量（n=6）Table 4 Determination of valbumin in commercial foods by UPLC-MS/MS (n= 6)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS法快速檢測(cè)食品中雞蛋過敏原卵白蛋白的方法。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法成功篩選到高特異性卵白蛋白肽段，并采用電噴霧質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、快速定量。該方法的建立為食品中雞蛋過敏原的檢測(cè)提供了技術(shù)支持，為推動(dòng)我國(guó)食品過敏原標(biāo)識(shí)的監(jiān)督與立法提供理論支持。