賀全國，李廣利,*，劉 軍，劉曉鵬，梁 靜，鄧培紅*

（1.湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽 421008）

人類食用含多巴胺（dopamine，DA）殘留的畜產(chǎn)品和海產(chǎn)品會因DA含量過高引發(fā)食物中毒。盡管DA已禁止在飼料和動物飲用水中使用，但非法使用情況仍屢見不鮮，因誤食殘留DA的食品引發(fā)的中毒事件時(shí)有發(fā)生。此外，DA含量的異常會引起帕金森和精神分裂癥等難治愈的神經(jīng)系統(tǒng)類疾病[1]。因此檢測人血清中DA含量對食品安全（如食品中毒物快速鑒定）和醫(yī)學(xué)臨床診斷方面具有重要意義。相對于高效液相色譜法、熒光光度法、化學(xué)發(fā)光法等方法，電分析方法具有簡便快速、成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，且無需大型儀器設(shè)備，已廣泛應(yīng)用于DA的檢測[2-3]。但DA、抗壞血酸（ascorbic acid，AA）、尿酸（uric acid，UA）共存于中樞系統(tǒng)細(xì)胞外液和血清中，在裸電極上三者的氧化峰電位接近，從而干擾DA的測定[4-5]。目前，化學(xué)修飾電極已成為解決這一問題的常用方法，金屬納米粒子修飾電極[6-7]、聚合物修飾電極[8]、碳納米管及其復(fù)合物修飾電極[9-11]、石墨烯及其復(fù)合物修飾電極[12-16]等均有報(bào)道。

納米Cu2O材料是一種環(huán)境友好的P型半導(dǎo)體材料，其特殊的電子結(jié)構(gòu)使Cu2O具有很多優(yōu)良的性能，廣泛應(yīng)用于太陽能電池[17]、光催化[18]和傳感器[19]等領(lǐng)域。受納米Cu2O材料分散性差的影響，單一納米Cu2O材料修飾電極難以用于藥物和生物分子的電分析。自2004年被發(fā)現(xiàn)以來，石墨烯因其具有優(yōu)異的導(dǎo)電性、高比表面積和良好的生物相容性等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于電分析領(lǐng)域。近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)展了Cu2O/石墨烯復(fù)合修飾電極技術(shù)。如Zhou Danling[20]、Mei Liping[21]等發(fā)展了納米Cu2O/還原氧化石墨烯復(fù)合修飾玻碳電極，對葡萄糖的檢測表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性和良好的選擇性。Jiang Binbin等[22]制備了納米Cu2O/氮摻雜石墨烯修飾玻碳電極，用于測定H2O2，具有較寬的線性范圍和低的檢出限。然而Cu2O復(fù)合石墨烯材料修飾玻碳電極測定DA鮮見報(bào)道。由于納米Cu2O相對于貴金屬納米粒子如Pt、Au成本更低，且制備簡單，倘若能采用Cu2O/石墨烯修飾電極檢測DA，將是非常有意義的嘗試。

電化學(xué)還原方法是一種綠色方法，無需使用強(qiáng)還原劑，反應(yīng)溫和可控[23]。實(shí)驗(yàn)室曾利用電化學(xué)還原法發(fā)展石墨烯及其復(fù)合物修飾的乙炔黑碳糊電極，成功用于色氨酸等生物活性物質(zhì)和多酚A等添加劑的電化學(xué)檢測[24-27]。本實(shí)驗(yàn)采用電化學(xué)還原方法制備納米Cu2O/還原石墨烯復(fù)合修飾電極（Cu2O-reduced graphene oxide nanocomposite modified glass carbon electrode，Cu2ORGO/GCE），進(jìn)一步探索和優(yōu)化電化學(xué)還原條件和電分析測試條件，并深入研究DA在復(fù)合修飾電極表面的電化學(xué)行為，最后將其應(yīng)用于DA樣品的檢測。希望利用納米Cu2O與還原石墨烯的協(xié)同作用，充分發(fā)揮Cu2O良好的電催化活性和還原石墨烯的高比面積、較強(qiáng)的表面吸附能力等優(yōu)勢，從而提高DA檢測的選擇性、靈敏度和線性范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DA 美國Fluka公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。所有溶液均用超純水（18.2 MΩ）配制。血清樣來自于株洲市人民醫(yī)院。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3000N掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM，帶有EMAX能譜儀） 日本Hitachi公司；JP 303極譜分析儀 成都儀器廠；CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器廠；X-射線粉末衍射（X-ray powder diffractometer，XRD）儀 日本理學(xué)（Rigaku）公司。

1.3 方法

1.3.1 納米Cu2O粒子、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）及Cu2O-GO復(fù)合材料制備

取50 mg CuSO4·5H2O和24 mg聚乙烯吡咯烷酮溶解在10 mL的超純水中，在超聲作用下攪拌30 min，形成透明的溶液。將2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液加入到上述透明溶液中，室溫下持續(xù)攪拌30 min，得到藍(lán)色沉淀Cu(OH)2。最后加入6 μL水合肼，室溫下持續(xù)攪拌20 min，得到磚紅色懸浮物，5 000 r/min離心，取其沉淀物即為Cu2O。經(jīng)多次純水和乙醇清洗后，再將其配制成1 mg/mL的納米Cu2O粒子水溶液。

GO采用改進(jìn)的Hummers方法[28]制備：先將23 mL濃H2SO4冷卻至0 ℃，將0.5 g石墨粉和0.5 g NaNO3加入到以上冷卻的濃H2SO4中，機(jī)械攪拌均勻；冰水浴控制溫度低于5 ℃，攪拌緩慢加入3 g KMnO4；接著升溫至35 ℃，攪拌2 h，形成糊狀物；溫度控制在50 ℃以下，慢慢加入40 mL H2O，然后升溫至95 ℃反應(yīng)0.5 h；隨后加入100 mL H2O，并將以上混合溶液分幾次攪拌加入到20 mL 30% H2O2溶液中，得到金黃色溶液；趁熱抽濾，先用150 mL鹽酸溶液洗，再用150 mL H2O清洗，最后取濾紙及其上面的固體50 ℃真空干燥，得到GO。將上述100 mg干燥的GO分散在100 mL蒸餾水中，超聲剝離2 h，離心2 次，除去沉淀物，取上層清液，得質(zhì)量濃度約為1 mg/mL金黃色GO溶液。將1 mL納米Cu2O粒子（1 mg/mL）分散液加入到20 mL上述GO溶液中，超聲分散2 h，得Cu2O-GO分散液。

1.3.2 Cu2O-GO/GCE的制備

分別用粒徑為1.0、0.3 μm和0.05 μm的α-Al2O3對玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）進(jìn)行拋光，依次將電極置于超純水、無水乙醇、超純水中超聲1 min，用高純氮?dú)獯蹈伞２捎玫瓮康姆绞綄u2O-GO分散液修飾在GCE表面，在紅外燈下烤干。最后利用電化學(xué)方法還原成石墨烯，即可制得Cu2O-RGO/GCE。

1.3.3 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

在磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）中加入不同量的DA，配制10 mL不同濃度DA溶液，測量前先通N2除氧。采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電極電化學(xué)性能測定。采用二階導(dǎo)數(shù)線性伏安法對DA測定，檢測前先在一定的富集電位下富集。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)三電極體系：裸電極、RGO或Cu2O-RGO修飾電極為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。循環(huán)伏安法在CHI 660E電化學(xué)工作站進(jìn)行，二階導(dǎo)數(shù)線性伏安法則在JP-303E型極譜分析儀進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

首先測定不同檢測條件（pH值、富集電位和富集時(shí)間）下氧化峰電流，得到最佳的檢測條件。然后在最佳檢測條件下采用二階導(dǎo)線線性掃描伏安法測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的氧化響應(yīng)峰，用Origin 9.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性擬合，得到線性方程。然后采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定真實(shí)樣品的氧化響應(yīng)峰電流，根據(jù)線性方程，計(jì)算樣品濃度的測定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 微觀形貌表征

圖1 R G O（A）、C u 2 O（B）及C u 2 O-R G O（C）S E M圖F i g. 1 S E M i m a g e s o f R G O, C u 2 O a n d C u 2 O-R G O

圖2 Cu2O納米粒子的XRD譜圖Fig. 2 XRD patterns of three different morphologies of Cu2O

由圖1可知，RGO為薄層彎曲綿延起伏狀態(tài)（圖1A），納米Cu2O納米顆粒呈正方體形狀，大小均一，粒徑約為150 nm（圖1B）。從圖1C可以清楚地看到RGO薄層覆蓋在納米Cu2O粒子表面，并呈絮狀起伏狀態(tài)，說明RGO與納米Cu2O粒子結(jié)合較好。圖2為納米Cu2O的XRD圖譜。對比Cu2O標(biāo)準(zhǔn)衍射卡（JSPDS78-2076）發(fā)現(xiàn)，納米Cu2O與標(biāo)準(zhǔn)卡衍射峰相吻合（虛線表示Cu2O標(biāo)準(zhǔn)卡上對應(yīng)的衍射峰），這表明已成功制備立方相的Cu2O納米材料。

2.2 電化學(xué)還原條件優(yōu)化結(jié)果

圖3 電化學(xué)過程還原電位和還原時(shí)間優(yōu)化Fig. 3 Optimization of reduction potential and reduction time for electrochemical reduction

電化學(xué)還原氧化石墨烯的電位一般在-1.5～-1.0 V。固定還原時(shí)間300 s，分別在不同還原電位（-1.7、-1.5、-1.2、-1.0、-0.8 V）制備復(fù)合修飾電極。如圖3所示，當(dāng)還原電位為-1.5 V時(shí)，DA（1×10-5mol/L）在復(fù)合修飾電極氧化峰電流ipa最大。固定還原電位為-1.0 V，分別在不同還原時(shí)間（60、120、180、240、300 s和360 s）下制備修飾電極。如圖3所示，60～300 s峰電流ipa隨還原時(shí)間延長而增大，300 s達(dá)到最大值，隨后峰電流保持穩(wěn)定。綜上所述，制備Cu2O-RGO/GCE修飾電極的最佳還原條件為還原電位-1.5 V，還原時(shí)間300 s。

2.3 電化學(xué)性能表征

圖4 裸電極、RGO或Cu2O-RGO修飾電極在5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的循環(huán)伏安圖（A）和Nyquist圖（B）Fig. 4 Cyclic voltammograms (A) and Nyquist plots (B) of bare electrode,and RGO or Cu2O-RGO modi fi ed electrode at 5 mmol/L K3Fe(CN)6

圖4A為裸GCE、RGO/GCE、Cu2O-RGO/GCE在5 mmol/L Fe(CN)63-/4-溶液中的循環(huán)伏安曲線，3種電極的還原峰電流ipc分別為8.808×10-5、1.187×10-4、1.311×10-4A。根據(jù)Randles-Sevcik方程計(jì)算，得到裸的GCE、RGO/GCE或Cu2O-RGO的有效電活性面積分別為0.075、0.101 cm2和0.112 cm2。裸電極的電化學(xué)活性面積計(jì)算值與實(shí)際幾何面積（Φ 3.0 mm，0.071 cm2）相符。RGO/GCE、Cu2O-RGO/GCE分別為裸電極的1.3 倍和1.5 倍，這與石墨烯和納米Cu2O具有高的比表面積密切相關(guān)。電化學(xué)活性面積的增大不僅有利于工作電極富集吸附更多的DA，同時(shí)還增加修飾表面的催化位點(diǎn)，可以加速催化DA的氧化還原反應(yīng)。還采用電化學(xué)阻抗譜研究了電極界面性質(zhì)，結(jié)果如圖4B所示。Nyquist圖半圓半徑大小代表電子傳遞電阻（Rct），電子傳遞電阻RGO/GCE略小于Cu2O-RGO/GCE，兩者明顯小于裸GCE電極。這主要是由于石墨烯具有高的導(dǎo)電性能，而Cu2O為半導(dǎo)體，這很好地解釋了Cu2O-RGO/GCE的Rct略大于RGO/GCE。

2.4 DA在不同修飾電極上的循環(huán)伏安響應(yīng)

在0.1 mol/L PBS中，不同修飾電極在1×10-5mol/L DA溶液中的循環(huán)伏安圖如圖5所示。DA在裸GCE上的響應(yīng)電流最?。╥pa=5.415 μA，ipc=3.899 μA），氧化還原峰矮而寬。DA在RGO/GCE的氧化還原峰電流有了較大提高（ipa=36.565 μA，ipc=31.149 μA），可能原因?yàn)椋?）RGO比表面積大，增加了電化學(xué)活性面積；2）RGO與待測物DA通過π-π相互作用，增強(qiáng)了DA在電極表面的吸附能力。DA在Cu2O-RGO/GCE的氧化還原峰電流最大（ipa=70.720 μA，ipc=51.558 μA），且峰形比較尖銳。這主要是由于RGO與納米Cu2O的協(xié)同作用：RGO導(dǎo)電性良好、比表面積大，增強(qiáng)了電化學(xué)活性面積和DA吸附；Cu2O對DA存在的電催化作用，即偶合了Cu+/Cu2+氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)電子在電極表面的快速傳遞，從而提高了DA的氧化還原峰電流[29]。

圖5 不同電極在含1×10－5 mol/L DA的0.1 mol/L PBS（pH 3.5）中的循環(huán)伏安圖Fig. 5 Cyclic voltammograms of different electrodes in 0.1 mol/L PBS containing 1 × 10–5 mol/L DA (pH 3.5)

2.5 測定條件的優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 介質(zhì)pH值的影響

分別考察DA在pH 2.0～5.5的PBS中的循環(huán)伏安行為。如圖6A所示，當(dāng)pH 3.5時(shí)，DA的響應(yīng)電流峰最大。故測定pH值優(yōu)選3.5。此外還發(fā)現(xiàn)在pH 2.0～5.5的PBS中，DA的氧化峰電位與pH值呈線性關(guān)系，線性方程為y=-0.063 14x+0.542 0（R2=0.984），斜率為-63 mV/pH，非常接近理論值-59 mV/pH，這表明DA的電化學(xué)氧化是等電子等質(zhì)子過程[30]。

圖6 介質(zhì)pH值及富集條件的影響結(jié)果Fig. 6 Effects of medium pH value and enrichment conditions

2.5.2 富集條件的影響

研究-0.3～0.2 V不同富集電位下的溶出曲線，發(fā)現(xiàn)溶出峰電流大小與富集電位密切有關(guān)。從-0.3～-0.1 V隨富集電位變正，溶出峰電流先增大；富集電位超過-0.1 V后，電位變正，峰電流逐漸降低（圖6B）。因此選用-0.1 V作為富集電位。如圖6B所示，改變富集時(shí)間，從30～150 s隨富集時(shí)間的延長，溶出峰電流增大；富集時(shí)間大于150 s后，富集時(shí)間延長，峰電流基本保持不變。因此選用150 s為測定富集時(shí)間。綜上所述，富集條件優(yōu)選富集電位-0.1 V、富集時(shí)間150 s。

2.5.3 掃描速率的影響

在pH 3.5、0.1 mol/L PBS中，掃描速率在30～300 mV/s范圍，1×10-5mol/L DA溶液在Cu2O-RGO/GCE修飾電極上的循環(huán)伏安圖如圖7A所示。隨著掃描速率的增加，背景電流顯著增加，且DA的氧化還原峰電流也隨之增加；由圖7B發(fā)現(xiàn)，DA的氧化峰電流（ipa）與還原峰電流（ipc）與掃描速率（v）在30～300 mV/s之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程分別為ipa=-0.026 8v-0.478 3（R2=0.990），ipc=0.033 9v+0.674 2（R2=0.998）。這表明DA在Cu2O-RGO/GCE修飾電極上的反應(yīng)受吸附過程控制[4]，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用富集方法增大電流響應(yīng)信號。盡管隨著掃描速率的增大峰電流不斷增大，但背景電流也會相應(yīng)增大。因此過高的掃描速率不適合測量峰電流，DA定量檢測掃描速率選擇100 mV/s。隨著掃描速率的增加，氧化峰電位正移，還原峰電位負(fù)移，并與掃描速率的對數(shù)（lnv）呈良好的線性關(guān)系（圖7C）。氧化還原峰電位與掃描速率的對數(shù)線性方程分別為Epa=0.042 4lnv+0.492，Epc=-0.029 5lnv+0.199。結(jié)合Lavrion方程[33]公式（1）、（2）與上述Epa/Epc-lnv線性方程的斜率，即可得電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)α為0.6，電子轉(zhuǎn)移數(shù)n=0.74≈1。將其代入公式（3），即可計(jì)算異相電子轉(zhuǎn)移速率為1.65 s-1。結(jié)合2.5.1節(jié)可知，修飾電極Cu2ORGO/GCE在pH 3.5的PBS測定DA屬于1電子1質(zhì)子快速傳遞過程，其ks值大于文獻(xiàn)報(bào)道值0.74 s-1[32]。

式中：E0’為電勢值/V；Epa和Epc分別表示氧化峰電位和還原峰電位/V；v為掃描速率/（V/s）；α為電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)；ks為異相電子轉(zhuǎn)移速率/s-1；n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)；T為開爾文溫度；F為法拉第常數(shù)（96 480 C/mol）；R為摩爾氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；D為擴(kuò)散系數(shù)/（cm2/s）；ΔEp為電位差/V。

圖7 電流與掃描速率關(guān)系圖Fig. 7 Effect of scan speed on the peak current

2.6 抗干擾測試結(jié)果

人體中同時(shí)共存DA、AA和UA三種相似的物質(zhì)，容易對DA檢測造成干擾。采用線性溶出伏安法，考察DA（1×10-5mol/L）與AA（1×10-5mol/L）、UA（1×10-5mol/L）共存時(shí)電流響應(yīng)。結(jié)果如圖8所示，DA、AA、UA三者的氧化峰電位得到了有效分離，P0、P1、P2代表AA、DA和UA的峰電位，AA-DA氧化峰電位差ΔEp為204 mV，DA-UA之間的ΔEp為144 mV。且與單獨(dú)測定DA相比，峰電流未見明顯減少。這說明石墨烯和Cu2O納米粒子兩者的協(xié)同效應(yīng)提高了選擇性和抗干擾能力。

圖8 DA、AA與UA混合液在Cu2O-RGO/GCE上線性掃描溶出伏安圖Fig. 8 Linear sweep stripping voltammograms at Cu2O-RGO/GCE in a mixture of DA

2.7 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化條件下，采用線性伏安法對DA進(jìn)行定量分析。如圖9A所示，當(dāng)DA濃度為1×10-8～1×10-6mol/L時(shí)，氧化峰電流ipa均隨濃度增大而增大，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為ipa=13.348c+3.839（R2=0.992）。當(dāng)DA濃度為1×10-6～8×10-5mol/L時(shí)，濃度與峰電流同樣呈線性關(guān)系（圖9B），線性方程為ipa=0.743 1c+19.125（R2=0.970）。式中：ipa為峰電流/μA；c為多巴胺的濃度/10-6mol/L。檢出限（RSN=3）為6.0×10-9mol/L。這一研究結(jié)果比文獻(xiàn)[15,33-37]報(bào)道的線性范圍更寬，儀器檢出限更低（表1）。

圖9 DA氧化峰電流與濃度的關(guān)系圖Fig. 9 Relationship between oxide peak ipa and DA concentration within the ranges of 1 × 10–8–1 × 10–6 mol/L and 1 × 10–6–8 × 10–5 mol/L

表1 Cu2O-RGO/GCE檢測DA效果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果對比Table 1 Comparison of dopamine detection using Cu2O-RGO/GCE and modi fi ed electrodes reported in the literature

2.8 樣品檢測結(jié)果

將一支鹽酸多巴胺注射液（標(biāo)示質(zhì)量濃度為10 g/L）定容至100 mL容量瓶中，再移取一定量的稀釋液，置于另一10 mL容量瓶中，用pH 3.5的0.1mol/L PBS稀釋至刻度，按上述實(shí)驗(yàn)方法測定。測定結(jié)果見表2，DA樣品測定值與標(biāo)示值基本相符，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為-3.20%～1.12%，回收率為96.5%～104.4%。這表明Cu2O-RGO/GCE能用于外源性實(shí)際樣品的檢測。為說明可用于內(nèi)源性DA的檢測，取1 mL的血清，用pH 3.5、0.1 mol/L PBS和一定量的DA標(biāo)液配成10 mL檢測溶液。所得結(jié)果見表3，從回收率可以發(fā)現(xiàn)修飾電極可用于血清中DA的檢測。

表2 鹽酸多巴胺針劑的測定結(jié)果（n=4）Table 2 Determination of dopamine in injection (n= 4)

=3）Table 3 Determination of dopamine in serum (n= 3)表3 血清中DA測定結(jié)果（n

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過電化學(xué)還原法制備Cu2O-RGO/GCE修飾電極，得到最佳還原條件為：還原電位-1.5 V，還原時(shí)間120 s。通過電鏡觀察到RGO均勻地覆蓋在納米Cu2O顆粒表面，說明RGO與納米Cu2O顆粒結(jié)合較好。通過循環(huán)伏安法對DA在Cu2O-RGO/GCE的電化學(xué)行為進(jìn)行研究，表明DA在修飾電極表面的反應(yīng)為1電子1質(zhì)子過程，并受吸附控制。AA和UA對等量的DA在Cu2ORGO/GCE表面產(chǎn)生的峰電流并沒受到明顯影響，顯示修飾電極對DA的測定具有較好穩(wěn)定性和選擇性。該修飾電極可應(yīng)用于血清中內(nèi)源性DA的檢測和外源DA（鹽酸多巴胺注射液）的檢測，表明該修飾電極可實(shí)際應(yīng)用于DA的定量檢測。