張聰聰 陳博雅 程乃萱 杜 杰

心力衰竭(heart failure, HF)是多種心血管疾病(高血壓、心肌梗死、先天性心臟病、瓣膜病等)導(dǎo)致的心臟病理性重構(gòu)的結(jié)果。HF患者會感到疲勞、乏力、嗜睡和身體活動能力下降, 及包括呼吸肌在內(nèi)的多種骨骼肌功能異常的表現(xiàn)。身體80%的蛋白質(zhì)由骨骼肌儲存，骨骼肌萎縮會導(dǎo)致全身性的營養(yǎng)不良，骨骼肌萎縮的程度能夠作為HF導(dǎo)致死亡的重要預(yù)測指標(biāo)[1-2]。因此，HF時(shí)骨骼肌蛋白分解代謝的研究具有重要意義。本研究采用主動脈弓橫向結(jié)扎(transverse aortic constriction, TAC)8周，復(fù)制小鼠HF動物模型[3]。采用實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime-PCR) 和Western blot 技術(shù)，檢測HF小鼠脛骨前肌內(nèi)Atrogin-1 和MuRF1的mRNA及蛋白表達(dá)變化，并采用Western blot 技術(shù)，檢測其上游轉(zhuǎn)錄因子FOXO1以及激酶AKT的磷酸化水平和總蛋白水平進(jìn)行測定，比較磷酸化蛋白表達(dá)與總蛋白的比率。通過觀察骨骼肌組織中上述指標(biāo)的變化，從而探討HF時(shí)骨骼肌萎縮的可能分子機(jī)制，并為有效的多靶點(diǎn)干預(yù)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL/6J小鼠20只，雄性，10周齡，體質(zhì)量20～23g，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物房提供。購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004，使用許可證號: SCXK(京)2015-0023。小鼠隨機(jī)分為兩組: 對照組(10只) 和HF模型組(10只)。

2. 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國),realtime-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)，Atrogin-1，MuRF1一抗(Abcam，美國)，F(xiàn)OXO1，p-FOXO1，AKT, p-AKT一抗(Cell Signaling Technology，美國)，GAPDH一抗(中杉金橋，中國)，DyLight 800標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(LI-COR，美國)。

3. TAC誘導(dǎo)心力衰竭模型制備 HF組小鼠使用1%戊巴比妥麻醉(70mg/kg體質(zhì)量)，從頸部剪開皮膚，游離甲狀腺，剪開胸骨，游離胸腺及主動脈弓周圍結(jié)締組織，充分暴露主動脈弓。使用5～0棉線結(jié)扎主動脈弓，以27號針為墊針結(jié)扎。結(jié)扎后撤出27號針頭，縫合胸骨和皮膚。對照組小鼠僅麻醉后剪開頸部皮膚剪開胸骨并暴露主動脈弓后進(jìn)行縫合。所有小鼠均普通飲食飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。分別于術(shù)前，術(shù)后1周，2周，4周，8周進(jìn)行小鼠稱重。術(shù)后1周，通過小動物超聲(VIVO，美國)檢測主動脈弓流速，以流速≥2 500mm/s為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后8周，測量心功能之后收取小鼠心臟組織，用10%中性甲醛固定后用于病理分析。同時(shí)無創(chuàng)游離小鼠雙側(cè)脛骨前肌，并進(jìn)行稱重，一側(cè)用10%中性甲醛固定后用于病理分析，另一側(cè)用液氮凍存用于mRNA和蛋白的提取。

4. 小鼠心功能測定 于TAC術(shù)后8周，通過小動物超聲進(jìn)行小鼠心功能測定，主要檢測指標(biāo)如下：室間隔厚度(interventricular septum，IVS)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPW)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVEDS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVESV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVEDV)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

5. 心臟組織、骨骼肌組織病理切片的制備方法同前[4]。取出已固定的心臟組織和脛骨前肌，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。HE染色：切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，蘇木素染色3min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30s；自來水返藍(lán)5min；置伊紅染色液2min；常規(guī)脫水，透明，封片。WGA染色：切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，檸檬酸緩沖液(pH=6.0)抗原修復(fù)90s，1 x PBS緩沖液洗3遍，羊血清封閉液室溫封閉30min，WGA工作液(10ug/mL, Sigma,美國)37℃,孵育60min，1 x PBS緩沖液洗3遍，DAPI封片。使用電子熒光顯微鏡(Nikon，日本)進(jìn)行病理圖像采集，使用NIS Br 3.0軟件進(jìn)行圖像分析。

6. realtime-PCR檢測小鼠脛骨前肌組織中Atrogin-1和MuRF1的mRNA水平 取相同質(zhì)量50 mg 的脛骨前肌放入勻漿器內(nèi)，加入1 mL Trizol(Invitrogen，美國)提取RNA，用Nanodrop 2 000測定RNA 的濃度和OD260 /280 比值。各樣本均按5μg RNA 相對應(yīng)的體積(n μL) 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系為20 μL 體系，將混合好的液體放置在PCR儀中，反應(yīng)條件為42℃, 60min;95℃, 5min。將反轉(zhuǎn)好的cDNA按照realtime-PCR 說明書進(jìn)行半定量PCR，使用Bio-RAD CFX Connect進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃, 2min;95℃,15s;60℃, 30min(40個循環(huán));60℃, 5s，每個循環(huán)增加0.5℃～95℃。以GAPDH作為內(nèi)參?；虻谋磉_(dá)水平以得到的相應(yīng)的Ct 值用2 (Ct GAPDH-Ct 目標(biāo)基因)法進(jìn)行計(jì)算。引物序列分別為: Atrogin-1∶5’- CGGGCTTCCTTGAGTGTCTT-3’(上游)，5’- GGCTCTCCTAAGGTCCCAGA-3’(下游)；MuRF-1∶5’- AAACTTGTGGA GACCGCCAT-3’(上游)，5’- TCTTGATGAGCTGCTTGGCA-3’(下游)；GAPDH：5’- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3’(上游)，5’-GCGGCACGTCAGATCCA-3’(下游)。

7. Western blot 測定小鼠脛骨前肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 取50mg脛骨前肌用300μL T-PER組織裂解液(含1x 0.5M EDTA, 1x蛋白酶抑制劑，1x磷酸酶抑制劑)(Thermo，美國)進(jìn)行裂解，12 000r/min,離心15min，后吸取上清。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品總蛋白濃度。將100μg蛋白與5x蛋白上樣緩沖液進(jìn)行混合后，100℃變性5 min。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉2h，再依次孵育稀釋后的一抗Atrogin-1(兔多抗，1∶1 000)，MuRF1(兔多抗，1∶1 000)，F(xiàn)OXO1(兔多抗，1∶1 000)，p-FOXO1(兔多抗，1∶1 000)，AKT(兔多抗，1∶1 000), p-AKT(兔多抗，1∶1 000)，GAPDH (鼠單抗，1∶1 000)，4℃孵育過夜。洗滌。敷二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1小時(shí)，稍洗。使用Odyssey 儀器進(jìn)行熒光掃描，并分析條帶灰度。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HF 模型的結(jié)果 (1)體質(zhì)量變化：TAC 術(shù)前和術(shù)后2周，4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的平均體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TAC 6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量明顯低于對照組小鼠(P<0.05)，TAC 8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量明顯低于對照組(P<0.01)，且體質(zhì)量下降已超過預(yù)計(jì)值的10%，出現(xiàn)營養(yǎng)不良改變。結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化 注:與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

(2)心功能變化：TAC術(shù)后8周時(shí)使用小動物超聲檢測兩組心功能各項(xiàng)指標(biāo)，其中HF組的EF值和FS值較對照組顯著下降(P<0.01，表1)。

(3)心臟組織形態(tài)學(xué)改變：心臟組織HE染色可見HF組小鼠心臟室壁厚度較對照組增加，心室內(nèi)徑增加。WGA染色觀察心肌細(xì)胞的面積發(fā)現(xiàn)HF組心肌細(xì)胞的面積大于對照組(P<0. 01，圖2)。

表1 兩組小鼠心功能比較

注：LVM：左心室質(zhì)量

圖2 小鼠心肌病理檢測 A:HE染色(放大倍數(shù)40X,標(biāo)尺500μm)；A心動衰竭組:心臟左心室室壁厚度的測量數(shù)據(jù)，與對照組相比，*P<0.05；B:WGA染色(放大倍數(shù)400X,標(biāo)尺50μm)，B心動衰竭組:根據(jù)WGA染色心肌細(xì)胞的橫截面面積，與對照組相比，** P<0.01

(4)骨骼肌組織形態(tài)學(xué)觀察：HF組脛骨前肌重量和脛骨長度比顯著低于對照組。HE染色可見HF組肌纖維橫截面積較對照組減小，經(jīng)過WGA染色統(tǒng)計(jì)分析肌纖維面積可見HF組肌纖維橫截面面積顯著小于對照組，每高倍鏡視野下肌纖維數(shù)量計(jì)數(shù)顯著高于對照組。提示HF組骨骼肌發(fā)生萎縮。見圖3～4。

圖3 小鼠脛骨前肌和脛骨長度比值, 與對照組相比，**P<0.01

圖4 小鼠脛骨前肌肌纖維病理分析 A:WGA染色(放大倍數(shù)X400,標(biāo)尺50μm)；B:每高倍視野(HPF)中肌纖維數(shù)量的統(tǒng)計(jì)；C:肌纖維面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果注：與對照組相比，**P<0.01

2.脛骨前肌中Atrogin-1和MuRF1 的mRNA 和蛋白表達(dá)變化 脛骨前肌realtime-PCR的結(jié)果顯示，HF組脛骨前肌中Atrogin-1的mRNA水平較對照組增加約3.8倍 (P<0.01); HF組脛骨前肌中MuRF1的mRNA水平較對照組增加7.2倍 (P<0.01，圖5)。Western Blot的結(jié)果顯示，Atrogin-1 的蛋白相對表達(dá)量HF組較對照組明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); MuRF1 的蛋白表達(dá)HF組較對照組增加(P<0.05，圖6)。

圖5 兩組小鼠脛骨前肌中Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表達(dá)水平 注:與對照組相比，**P<0.01

圖6 兩組小鼠脛骨前肌中Atrogin-1和MuRF-1的蛋白表達(dá)水平 注:與對照組相比，**P<0.01

3.脛骨前肌中AKT/FOXO1信號通路的活化變化 Western blot 分析結(jié)果顯示，AKT和FOXO1總蛋白的表達(dá)量在HF組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。磷酸化AKT和磷酸化FOXO1的水平在HF組顯著增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p-AKT/AKT和p-FOXO1/ FOXO1的比值在HF組顯著增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)。

圖7 A:兩組小鼠脛骨前肌中p-FOXO1和FOXO1的蛋白表達(dá)水平；B:兩組小鼠脛骨前肌中p-AKT和AKT的蛋白表達(dá)水平，注:與對照組相比，*P<0.05; 與對照組相比，**P<0.01

討 論

根據(jù)中國心力衰竭注冊登記記錄統(tǒng)計(jì)，中國35～74歲人群慢性心力衰竭患病率為0.9%，并呈上升趨勢，其中住院心力衰竭患者的病死率約為5.3%[5]。心力衰竭患者骨骼肌萎縮的程度直接影響疾病的預(yù)后情況[2]。心力衰竭引起骨骼肌病變的主要表現(xiàn)為：①重量減輕；②結(jié)構(gòu)改變, 如肌纖維面積變小、I型纖維向Ⅱ型纖維轉(zhuǎn)變、線粒體減少；③能量代謝的改變，蛋白水解、糖酵解增加；④細(xì)胞因子及氧化標(biāo)記物表達(dá)增加等[6]。心力衰竭患者發(fā)生骨骼肌萎縮是一種多因素、多種分子生物學(xué)機(jī)制共同參與的復(fù)雜過程[7]，其最終歸結(jié)為骨骼肌蛋白合成和降解之間的不平衡，蛋白降解途徑增加程度大于蛋白合成，導(dǎo)致骨骼肌萎縮。我們在本研究中使用TAC 8周建立小鼠HF模型，發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌重量減輕，肌纖維面積減小，提示小鼠HF導(dǎo)致骨骼肌萎縮的模型成功，可以為研究小鼠骨骼肌萎縮的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

國內(nèi)外的研究顯示，骨骼肌萎縮過程中的蛋白質(zhì)的降解途徑主要包括溶酶體途徑、泛素-蛋白酶體途徑和Ca2+依賴性途徑等[8]，其中泛素-蛋白酶體途徑最為重要。在肌肉中特異性表達(dá)的E3 泛素連接酶主要為MAFbx (muscle atrophy F-box,又稱為Atrogin-1)和MuRF-1 (muscle RING finger 1)，這兩個分子屬于成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen, MyoD)降解過程中的核蛋白[9]。在發(fā)生HF的心臟組織中Atrogin-1和MuRF-1可出現(xiàn)高表達(dá)[10-11]。Li 等的實(shí)驗(yàn)證明,腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor，TNF)-α可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) p38亞基來調(diào)節(jié)Atrogin-1的表達(dá)[12]。細(xì)胞因子胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)-1的表達(dá)可以抑制Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)從而抑制骨骼肌萎縮的發(fā)生[13]。先前有研究顯示在慢性阻塞性肺疾病導(dǎo)致的骨骼肌萎縮過程中骨骼肌中的Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)就顯著增加[14]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)HF小鼠的骨骼肌中兩種泛素連接酶Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)顯著增加，這兩個分子可能引起骨骼肌中蛋白質(zhì)的泛素化增加, 促進(jìn)其被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解，發(fā)生骨骼肌萎縮。

轉(zhuǎn)錄因子FOXOs 家族是一類擁有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，主要包括FOXO-1 和FOXO-3 等。FOXOs 蛋白通過其C末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與靶基因的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)靶基因的表達(dá)[15]。當(dāng)FOXOs被上游的信號分子如AKT等磷酸化后使其由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解，表達(dá)降低，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，從而抑制其對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。研究顯示FOXOs可以通過調(diào)控自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄引起骨骼肌細(xì)胞的自噬，同時(shí)可以促進(jìn)肌細(xì)胞中MyoD的表達(dá)影響肌纖維的分化[16-17]。最近的研究也顯示FOXO1可以直接結(jié)合至與骨骼肌萎縮密切相關(guān)的Atrogin-1 和MuRF1的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域，從而調(diào)節(jié)Atrogin-1 和MuRF1的表達(dá)[18]。研究顯示骨骼肌特異性敲除FOXO1基因?qū)⒁种茝U用性骨骼肌萎縮或去神經(jīng)性骨骼肌萎縮的發(fā)生[19-20]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)HF組骨骼肌組織中FOXO1的磷酸化水平增加，同時(shí)FOXO1總蛋白水平下降，提示在心力衰竭導(dǎo)致骨骼肌萎縮的過程中存在負(fù)向調(diào)控分子導(dǎo)致FOXO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力下降從而抑制骨骼肌萎縮的發(fā)生。

AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)的協(xié)同作用下，磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)與胞漿內(nèi)AKT 結(jié)合，AKT轉(zhuǎn)位 到質(zhì)膜，并促進(jìn)Ser473 和Thr308 位點(diǎn)磷酸化。Ser473或/和Thr308 位點(diǎn)的磷酸化是AKT 激活的必要條件，活化狀態(tài)下的AKT 使轉(zhuǎn)錄因子FOXO1 磷酸化后從細(xì)胞核中移出，并在細(xì)胞漿中被泛素蛋白酶體所降解，從而抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性[21]。Atrogin-1 和MuRF1 受FOXOs 轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，而AKT 可使FOXOs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能失活。本研究中發(fā)現(xiàn)HF小鼠的骨骼肌中AKT和FOXO1的磷酸化顯著高于對照組，提示骨骼肌中存在激活A(yù)KT下調(diào)FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制Atrogin-1 和MuRF1表達(dá)抑制骨骼肌萎縮的負(fù)性調(diào)控因子。另一方面，磷酸化的AKT可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1,4E-BP1)、核糖體S6激酶1(ribosome protein subunit 6 kinase 1, S6K1)信號通路，并阻礙抑制蛋白質(zhì)合成因子糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)活性，促進(jìn)蛋白合成[22-23]，啟動負(fù)向調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，心力衰竭的骨骼肌中蛋白降解相關(guān)基因Atrogin-1 和MuRF1的表達(dá)顯著上調(diào)促進(jìn)骨骼肌萎縮的形成。同時(shí)骨骼肌中AKT/FOXO1信號通路活化，啟動負(fù)向調(diào)控機(jī)制，可能發(fā)揮抑制骨骼肌萎縮的作用，成為機(jī)體的一個代償機(jī)制。但是具體何種分子激活A(yù)KT/FOXO1信號通路尚需進(jìn)一步的探索。本研究的發(fā)現(xiàn)為治療心力衰竭骨骼肌萎縮提供一個新思路，即干預(yù)AKT/FOXO1 信號通路上的某些靶點(diǎn)使其進(jìn)一步激活，從而達(dá)到抑制骨骼肌萎縮的目的。