田其英 華欲飛 陳業(yè)明 孔祥珍 張彩猛 王 靜
(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院,江蘇 淮安 223005)
大豆是重要的糧油作物之一,油脂含量在20%以上,所含油脂貯存在大豆油體中。大豆油體的主要成分有3種,分別為中性脂(主要為甘油三脂)、油體蛋白和磷脂[1]。大豆經(jīng)過(guò)浸泡、磨碎制成的豆?jié){中存在著大量的油體,這些油體釋放的脂質(zhì)及其產(chǎn)物可以作為酶促氧化的底物,被脂肪氧合酶催化氧化后產(chǎn)生大量的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。Andre等[2]研究發(fā)現(xiàn)在此酶促氧化產(chǎn)生大豆制品豆腥味的過(guò)程中,關(guān)鍵的酶是脂肪氧合酶(Lipoxygenase, Lox)。為了探索豆制品揮發(fā)性風(fēng)味的形成機(jī)理,很多研究者[3-4]選用不飽和脂肪酸為底物,Lox或Lox同工酶為催化劑。此外,還對(duì)大豆的品種、種植地域、貯藏期、加工工藝等對(duì)豆腥味的影響進(jìn)行了大量研究[5-7]。而以脂質(zhì)貯存細(xì)胞器大豆油體為底物的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步研究豆?jié){在磨漿過(guò)程中的風(fēng)味形成機(jī)理,可以建立豆?jié){風(fēng)味形成模擬體系,即以一定濃度的大豆油體,加上一定活力的Lox、磷脂酶等,混合均勻制成乳濁液。大豆油體作為模擬體系中的底物組分,其提取的效果對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有著重要影響。
大豆油體可看成一種天然的乳化油滴粒子,其內(nèi)部脂質(zhì)被單層磷脂—內(nèi)源性蛋白質(zhì)組成的生物膜包裹保護(hù)起來(lái)[8]。然而在磨漿過(guò)程中,油體在機(jī)械、酶等作用的同時(shí)其表面會(huì)吸附一些大豆蛋白組分。為除去油體表面吸附的蛋白,以往研究者[9-11]分別用一定濃度尿素、氯化鈉、蔗糖等提取或進(jìn)行加熱、調(diào)節(jié)pH處理都取得了一定的純化效果。為保證提取油體的純度和穩(wěn)定性,以及減少對(duì)豆?jié){風(fēng)味形成模擬體系的影響,本研究擬選用蔗糖為提取試劑,通過(guò)調(diào)整提取次數(shù)和pH來(lái)提取滿足相應(yīng)要求的油體。以期為植物油體的提取純化和相關(guān)研究提供參考。
大豆:嫩江富民農(nóng)副產(chǎn)品有限公司;
蔗糖:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;
丙烯酰胺、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、巰基乙醇、三羧基氨基甲烷(Tris) 、甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED) 、考馬斯亮藍(lán)G250:分析純,美國(guó)Sigma公司;
標(biāo)準(zhǔn)蛋白:美國(guó)Bio-Rad公司;
磁力攪拌器:90型,上海瀘西儀器分析廠;
漩渦混合儀:WH-1 微型,上海瀘西分析儀器廠;
pH計(jì):PHS-3C型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;
組織搗碎機(jī):MJ-60BE01B型,美的電器有限公司;
超速冷凍離心機(jī):HitachiCR21G型,日本日立公司;
粒徑/Zeta電勢(shì)儀,ZETA-SIZER 2000型,英國(guó)Malvern公司;
垂直電泳儀:Mini-PROTE836AN 型,美國(guó)Bio-Rad 公司;
凝膠成像儀:ChemiDocXRS+型,美國(guó)Bio-Rad公司;
氣質(zhì)聯(lián)用儀:SCIONSQ-456-GC型,美國(guó)bruker公司。
1.2.1 生豆?jié){的制備 將20 g大豆浸泡在9倍質(zhì)量的去離子水中,于4 ℃冰箱放置18 h。向吸脹的大豆中加入新鮮去離子水至總重為200 g,用組織搗碎機(jī)以18 000 r/min磨漿90 s,用4層紗布過(guò)濾除去豆渣,濾液稱為生豆?jié){。
1.2.2 大豆油體的提取 對(duì)趙路蘋(píng)等[10]的方法進(jìn)行了改進(jìn),以便于得到純度和穩(wěn)定性均較好的大豆油體。向生豆?jié){中分別加入15%濃度的蔗糖,室溫?cái)嚢?0 min,調(diào)節(jié)pH值。轉(zhuǎn)移到離心管中,在4 ℃條件下,19 000 r/min 離心30 min,收集上浮物提取油體,或再將所得油體均勻溶解于10倍質(zhì)量的水中,添加相同濃度的蔗糖,調(diào)回原來(lái)的pH值,在相同條件下離心,重復(fù)上述操作。上浮物即為大豆油體。
1.2.3 粒徑測(cè)定 用粒徑/Zeta電勢(shì)儀測(cè)粒徑分布。
1.2.4 油體的顯微鏡觀察 滴1滴合適濃度的乳液在載玻片上,蓋好蓋玻片,在400×顯微鏡(10倍目鏡×40倍物鏡)下觀察大豆油體。通過(guò)測(cè)量并計(jì)算顯微鏡照片中油體的粒徑范圍和平均粒徑。
1.2.5 油體主要成分(中性脂、蛋白質(zhì)、磷脂)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]。
1.2.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè) 對(duì)Jung等[13]的檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)。提取的油體按照得率進(jìn)行溶解稀釋,以濃度為0.502 5 mg/mL 的2-甲基-3-庚酮溶液為內(nèi)標(biāo)物,萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min、解吸時(shí)間7 min、萃取頭為85 μm CAR-PDMS,測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)。
1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) SDS-PAGE根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法,樣品處理修改如下:樣品溶解液為0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),1% SDS,2% 巰基乙醇和0.02%溴酚藍(lán)。取油體樣品0.5 mL,加入0.5 mL樣品溶解液,在漩渦混合儀上混勻,煮沸3 min,12 000 r/min離心10 min,取下層清液上樣。
大豆油體蛋白主要為24,18,16 kDa 3種相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。其中,24 kDa油體蛋白含量最多,其次是 18 kDa油體蛋白,16 kDa油體蛋白含量最少[15]。在磨漿過(guò)程中,吸附到油體表面的蛋白主要有β-伴大豆球蛋白(圖1條帶中的α+α′、β),大豆球蛋白如圖1條帶中的酸性肽鏈3(A3)、酸性肽鏈(Acidic)和堿性肽鏈(Basic),γ-伴大豆球蛋白,30 kDa蛋白和脂肪氧合酶等[9]。由圖1可知,從生豆?jié){中提取油體隨著提取次數(shù)的增加,油體蛋白的總量在減少,其中α+α′、β、γ-伴大豆球蛋白、A3、Acidic、Lox減少較多,24 kDa蛋白有所減少,Basic、18 kDa和30 kDa蛋白變化不大。隨著提取次數(shù)的增加,吸附蛋白減少越多表明其與油體蛋白的吸附力越弱。這也說(shuō)明在中性條件下外源性蛋白與油體的結(jié)合力大小并不相同,超過(guò)3次提取還會(huì)導(dǎo)致油體內(nèi)源性蛋白的脫離。脂肪氧合酶是油脂催化氧化形成風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵酶,會(huì)導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)的大量產(chǎn)生,需要盡可能減少其存在。
圖1 提取次數(shù)對(duì)油體表面蛋白的影響Figure 1 The effect of different extraction times on surface protein of oil body
由圖2可知,從生豆?jié){中提取油體的蛋白質(zhì)逐漸減少,當(dāng)提取pH值>9時(shí),油體中附著的β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白中的A3和Acidic、γ-伴大豆球蛋白和脂肪氧合酶以及內(nèi)源性蛋白18 kDa減少較為明顯,它們與油體蛋白的吸附力較弱;30 kDa蛋白只在pH值達(dá)到11時(shí)才有較大幅度的減少;Basic和24 kDa油體蛋白隨著pH值的增大基本不變,Basic與油體蛋白的吸附力較強(qiáng)。說(shuō)明在堿性條件可以破壞大多數(shù)外源蛋白與油體之間的相互作用,導(dǎo)致提取的油體蛋白含量降低,在較高堿性條件下可以得到純度較好的油體。這與Chen等[16]的研究結(jié)果基本一致。
圖2 提取pH值對(duì)油體表面蛋白的影響Figure 2 The effect of different pH values on surface protein of oil body
大豆油體可看成是內(nèi)部為甘油三酯中性脂,外層由蛋白質(zhì)—磷脂膜包裹的乳化油滴粒子[8]。由表1可知,隨著提取油體pH值的增大,中性脂肪含量呈增大的趨勢(shì),磷脂和蛋白質(zhì)含量呈減小的趨勢(shì),其中蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)與2.2結(jié)果相一致。造成磷脂含量減少的原因可能是,在堿性條件下促進(jìn)了外源性蛋白和油體蛋白脫離油體,影響了磷脂和油體蛋白結(jié)構(gòu),使少量磷脂脫離油體析出;再者強(qiáng)堿環(huán)境使磷脂分子結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞,導(dǎo)致磷脂含量減少。
表1不同pH下提取大豆油體的主要成分及含量
Table 1 The components and contents of soybean oil body extracted at different extraction pH %
和其他油料種子中的油體相比較,大豆油體因較低的油與界面蛋白比,故體積較小,其直徑在 0.2~0.5 μm[16-17]。利用400×顯微鏡觀察提取的大豆油體,如圖3所示,油體形狀比較規(guī)則、完整,呈小球體,直徑在0.33~0.43 μm,油體直徑隨著提取pH值的增大呈下降的趨勢(shì)。
對(duì)不同pH值下提取的油體進(jìn)行粒徑測(cè)定,并進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2。由結(jié)果F值>F臨界值,并且P值(7.84E-09)<0.01,可以判定不同pH值下提取的油體粒徑大小具有顯著型差異。從圖4可知,當(dāng)提取油體pH值>8時(shí),所提取的油體粒徑減小顯著,當(dāng)提取pH值>10時(shí),油體粒徑減小變緩。說(shuō)明隨著提取pH值的增大,提取油體的表面結(jié)合力較小的蛋白質(zhì)先脫離油體,而結(jié)合力較大的蛋白質(zhì)相對(duì)較少且脫離難度加大,同時(shí)伴隨著油脂的損失,導(dǎo)致油體粒徑相應(yīng)的變化。
圖3 不同pH值下提取大豆油體的顯微結(jié)構(gòu)(400×)
Figure 3 The microstructure of oil body was extracted under different pH values (400×)
表2 油體粒徑方差分析Table 2 Variance analysis of oil particle size
圖4 pH值對(duì)提取油體的粒徑影響Figure 4 The effect of pH values on particle size of oil body
豆?jié){的氣味特征是由多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同產(chǎn)生的結(jié)果,Kobayashi 等[18]研究豆?jié){氣味的組成,分離出了36種氣味成分(其中有4種為未知成分)。根據(jù)前人[19]對(duì)豆?jié){風(fēng)味貢獻(xiàn)度大下分析歸類及本研究中鑒定出來(lái)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)情況,選擇醛、醇、酮、呋喃類等16種風(fēng)物質(zhì)作為研究對(duì)象。
由表3可知,隨著提取pH值的增大,提取油體的風(fēng)味物質(zhì)總量逐漸減少,在pH值>9時(shí)大豆脂肪氧合酶含量減少,活性減弱,導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)總量驟減,pH 10和pH 11條件下提取油體含有的風(fēng)味物質(zhì)的量分別占豆?jié){風(fēng)味的3.65%和3.38%。強(qiáng)堿性提取的大豆油體中催化酶完全被洗脫干凈,依然存在少量的風(fēng)味物質(zhì),這主要是油體吸附豆?jié){生成的風(fēng)味物質(zhì)導(dǎo)致的[20]。
從生豆?jié){中提取油體,提取次數(shù)增加和提取pH值增大,會(huì)促進(jìn)解離油體表面附著的外源性蛋白,使所提取的油體蛋白含量減少;但對(duì)油體蛋白24 kDa和油體蛋白18 kDa影響不大,從而使得在較高pH值下提取的油體保持了其形態(tài)的規(guī)則和完整。為了保持豆?jié){模擬體系中大豆油體的純度、穩(wěn)定性和避免脂肪氧合酶等的影響,選用在pH 10下提取3次所得的大豆油體最為合適。
表3 豆?jié){和提取油體的風(fēng)味物質(zhì)Table 3 The flavor substances of soybean milk and oil body extracted μg/L
本研究提取的合適油體只是作為豆?jié){模擬體系的底物成分,在此模擬體系中油體在酶解或酶催化作用下的氧化反應(yīng)和風(fēng)味形成還有待進(jìn)一步研究。