魏燕超 曹建昕 劉滿順 劉永峰

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

中國草地資源豐富，羊肉、牛肉產(chǎn)量豐厚分別居世界第1、3位[1]。牛、羊肉均是重要的高營養(yǎng)畜產(chǎn)品，近些年由于生活水平的提高，消費(fèi)者的關(guān)注焦點(diǎn)已從肉制品的重量轉(zhuǎn)至質(zhì)量[2]。而決定肉質(zhì)量高低的指標(biāo)主要有嫩度、色澤等食用品質(zhì)[3]，眾多食用品質(zhì)與體內(nèi)多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、組成及其相互間的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)[4]。剪切力是反映肉嫩度的常用指標(biāo)，不同部位肉的剪切力與肉嫩度密切相關(guān)[5]。魏秀麗等[6]用蛋白質(zhì)的溶解度反映蛋白的降解來研究動物宰后肌原纖維蛋白變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的破壞及降解會使蛋白水合力改變而引起肌肉的持水性發(fā)生改變，從而改善了肉的嫩度。色澤是決定消費(fèi)者購買與否最直觀、影響最大的因素[7]，研究[8]表明肌肉內(nèi)肌紅蛋白等相關(guān)蛋白質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化及其蛋白穩(wěn)定性、溶解性是影響肉色的本質(zhì)原因，此外，pH值的變化也會導(dǎo)致肉色的改變。

鑒于牛、羊均為牛屬的食草性動物[9]，且均為食用較廣的紅肉，它們不同部位肌肉的色澤、嫩度、蛋白結(jié)構(gòu)等均存在差異，但前人鮮有比較研究牛、羊肉宰后食用品質(zhì)的差異，尤其通過宰后蛋白的變化分析品質(zhì)差異的研究甚少。所以，本研究選取因含高蛋白、低脂肪、低膽固醇、豐富的氨基酸及礦物質(zhì)等被稱之為“肉中驕子”“肉中人參”的陜北著名的地方標(biāo)志性產(chǎn)品的秦川牛肉、橫山羊肉為研究對象[10-12]，就它們的色澤、pH值、剪切力、肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的溶解度及聚合降解情況進(jìn)行研究分析，以期為牛、羊肉的品質(zhì)調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及材料

1.1.1 原料肉

隨機(jī)選取最適屠宰年齡(屠宰率最高)的未去勢的秦川公牛和陜北白絨山羊公羊，即18月齡秦川公牛3頭、10月齡陜北白絨山羊公羊3只[13-14]。宰后立即取牛背最長肌(NH)、牛腹部肌肉(NL)、羊背最長肌(YH)和羊腹部肌肉(YL)各200 g于離心管中，在干冰中運(yùn)回實(shí)驗室后(-78～-80 ℃)，平均分割為6份，儲存于-80 ℃冰箱中作為后續(xù)試驗樣品。

1.1.2 試驗儀器

色差計：CR-10型，深圳壹博源有限公司；

pH計：E201-F型，上海雷磁儀器廠；

搖床：TS-1型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

電子天平：JA2003N型，上海精密儀器有限公司；

全波長酶標(biāo)儀：Multiskan Go型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

凝膠成像儀：BIO-BEST200E型，美國SIM公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA. XT. Plus型，英國Stable Micro System公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市岸頭儀都儀器廠；

蛋白電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra System型，美國Bio-Rad公司；

冰箱：DW-HL398S型，中科美菱低溫科技股份有限公司；

離心機(jī)：TGL-16gR型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.1.3 試驗試劑

蛋白Marker：電泳試劑，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；

Loading buffer、BCA試劑盒：北京康為試劑公司；

磷酸二氫納、磷酸氫二鈉、碘化鉀：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

SYPRO Ruby染色液：電泳試劑，美國Invitrogen公司；

十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)、丙烯酰胺、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甲叉雙丙烯酰胺：分析純，美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 pH值的測定 分別將肉樣剔除筋膜后剪成碎末，稱取10 g處理好的肉末于50 mL三角瓶中，再加入10 mL蒸餾水，室溫靜置10 min，使用pH計測定樣品pH值[6]。

1.2.2 色澤的測定 將肉樣除去筋膜、脂肪等物質(zhì)，稱取1 g樣品于空氣中靜置3 min。用黑白版校正色差計后，設(shè)定容差為2 SDCM，測定樣品色度L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)值。

1.2.3 剪切力的測定 參考NY/T 1180—2006測定方法。分別將待測樣品剔除筋膜等雜質(zhì)，沿肌纖維方向切成近似6 cm×6 cm×3 cm的肉塊，并置于80 ℃恒溫加熱至肉樣內(nèi)部溫度達(dá)到70 ℃后取出，在室溫中冷卻后，切成近似1 cm×1 cm×3 cm的小塊，用質(zhì)構(gòu)儀測定剪切力，設(shè)置速度為60 mm/min，探頭距離為25 mm。

1.2.4 蛋白質(zhì)溶解度的測定 參考Bowker等[15]的方法。肌漿蛋白溶解度的測定：分別取1 g肉樣于10 mL磷酸緩沖液中(0.25 mol/L，pH 7.2)，在冰上勻漿后，于4 ℃搖床過夜。次日于2 500 r/min離心20 min后，取上清液，用BCA(Bicinchoninic acid)法測定的蛋白濃度即為肌漿蛋白溶解度；全蛋白溶解度的測定：分別取1 g肉樣于含1.1 mol/L KI的磷酸緩沖液中(0.1 mol/L，pH 7.2)，在冰上勻漿后，于4 ℃搖床過夜。次日于2 500 r/min離心20 min后，取上清液，用BCA法測定的蛋白濃度即為全蛋白溶解度；肌原纖維蛋白溶解度按式(1)計算：

c=c1-c2，

(1)

式中：

c——肌原纖維蛋白溶解度，μg/μL；

c1——全蛋白溶解度，μg/μL；

c2——肌漿蛋白溶解度，μg/μL。

1.2.5 SDS-PAGE電泳

(1) 蛋白提取：參考Huang等[16]的方法。分別稱取1 g樣品于離心管，加入6 mL緩沖溶液(0.1 mol/L Tris pH 8.3、0.01 mol/L DTT)，在冰上勻漿后，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用于肌漿蛋白的分析。在剩余沉淀中加入25 mL 5% SDS緩沖溶液，渦旋、混勻，待沉淀溶解后，于80 ℃水浴30 min，分裝并置于-80 ℃保存，用于肌原纖維蛋白的分析。通過BCA法測定蛋白濃度，并用全波長酶標(biāo)儀測定其吸光度值。

(2) SDS-PAGE電泳：電泳采用15%分離膠和5%濃縮膠。分別將提取的蛋白樣品與Loading buffer混合后，于沸水水浴3 min后冷卻至室溫，在3 000 r/min離心2 min后取上清液8 μg，上樣。電泳過程中，初始電壓為80 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至130 V，待溴酚藍(lán)距離凝膠底部約0.5 cm處，關(guān)閉電源，停止電泳。

(3) 染色：將凝膠浸入到含40%甲醇和10%乙酸的100 mL 溶液中，于搖床上放置2 h后，棄去溶液后，用100 mL 雙蒸水洗滌2次，每次10 min；完成上述操作后，加入SYPRO Ruby染色并沒過凝膠，避光染色過夜。染色完成后，棄去染色液，加入100 mL脫色液(含7%乙酸和10%乙醇)沒過凝膠，于搖床上脫色2 h。

(4) 凝膠成像：完成脫色后，采用凝膠成像儀采集圖像。光源波長為254 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)平行測定3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析選用SPSS 17.0軟件，多重比較方法選用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值

由圖1可知，宰后羊肉腹部肌肉的pH值顯著高于背最長肌肌肉(P<0.05)，但牛肉在兩個部位中pH值無顯著差異(P>0.05)。比較同一部位牛、羊肉的pH值可知，牛、羊肉在背最長肌和腹部組均有顯著性差異(P<0.05)，且在2個部位羊肉的pH值均顯著高于牛肉的(P<0.05)，分別高出5.40%，5.65%。

動物在宰后過程中，肌肉的pH值與肉的色澤、持水性、嫩度等品質(zhì)有至關(guān)重要的聯(lián)系[17]。動物宰后，有氧呼吸停止，代謝由有氧代謝轉(zhuǎn)變成無氧代謝，其中主要以糖酵解為代表，因此產(chǎn)生乳酸的速率加快，從而使得pH值發(fā)生改變[18]。試驗結(jié)果表明，宰后羊肉組2個部位的pH值均高于牛肉組的，且背最長肌的高于腹部肌肉的，表明宰后羊肉的糖酵解力較牛肉稍強(qiáng)，背最長肌的糖酵解力較高，與馬曉冰等[19]的研究結(jié)果一致。

不同小寫字母表示同一物種不同部位差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一部位不同物種間差異顯著(P<0.05)

圖1 YH、YL、NH和NL組的pH值

Figure 1 pH of YH, YL, NH and NL groups after slaughter

2.2 色澤

由圖2可知，宰后牛肉、羊肉背最長肌的L*值顯著高于腹部肌肉(P<0.05)，分別高出13.21%，6.29%，說明背最長肌較腹部肌肉的亮度更好，而同一部位肉塊中，羊肉的L*值均顯著大于牛肉的(P<0.05)，背最長肌和腹部肌肉分別高出9.16%和16.27%。比較a*值發(fā)現(xiàn)，羊肉的背最長肌顯著大于腹部肌肉(P<0.05)，高出46.10%，但牛肉2個部位的a*值無顯著差異(P>0.05)，說明羊肉的背最長肌較腹部肉質(zhì)偏紅，但牛肉在這2個部位的紅度值區(qū)別不明顯；牛、羊肉在同一部位背最長肌肉質(zhì)中a*值無顯著差異(P>0.05)，但在腹部組中，牛肉的a*值顯著大于羊肉的，高出54.48%，說明牛羊肉的背最長肌肉色中的紅色相差較小，但牛肉的腹部較羊肉的腹部顏色更偏紅。與a*值相反，羊肉的背最長肌和腹部肌肉的b*值無顯著差異(P>0.05)，但牛肉背最長肌的b*值顯著大于腹部的(P<0.05)，高出21.34%；同一部位牛、羊肉b*值的變化趨勢同a*值，在背最長肌中無顯著差異(P>0.05)，但在腹部組中，羊肉的b*值顯著大于牛肉的(P<0.05)，高出16.93%。

肉的色澤與動物品種、環(huán)境因素及纖維類型有關(guān)，且肉色主要由肌紅蛋白及其相關(guān)蛋白所決定[20]。除此之外，潘曉建等[18]還發(fā)現(xiàn)，肌肉的pH值也與肉色及其穩(wěn)定性有關(guān)聯(lián)。pH值對肉色的影響機(jī)理為，當(dāng)肉的pH值高于肌肉蛋白等電點(diǎn)時，肌肉的束縛水能力與肌肉表面對光線的吸收能力增強(qiáng)，這會使得肉的表觀顏色加深，與上述研究得出的腹部較背最長肌pH值大，但亮度較背最長肌差相一致。有研究[21]發(fā)現(xiàn)，pH值較高時可改變肌紅蛋白的吸收特征，使得肉色變暗紅。也有研究者[22]發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白氧化程度與肉a*值呈負(fù)相關(guān)，這是由于氧化使得肌紅蛋白結(jié)構(gòu)改變，降低了肌紅蛋白結(jié)合氧氣的能力，從而使得a*值減小。結(jié)合上述肌漿蛋白溶解度分析，背最長肌的溶解度較腹部大，與背最長肌的a*值比腹部大相一致。Tang等[23]也曾研究認(rèn)為肌漿中還原型谷胱甘肽的含量與肉的L*值呈負(fù)相關(guān)，與a*值呈正相關(guān)，且有助于提高牛骨骼氧合肌紅蛋白的穩(wěn)定性，通過本文的電泳分析(見圖5)，未發(fā)現(xiàn)有此現(xiàn)象。

不同小寫字母表示同一物種不同部位差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一部位不同物種間差異顯著(P<0.05)

圖2 YH、YL、NH和NL組的色澤

Figure 2 Color of YH, YL, NH and NL groups after slaughter

2.3 剪切力

由圖3可知，在牛、羊肉組中，宰后腹部的剪切力均顯著大于背最長肌的(P<0.05)，分別高出3.83%，5.66%。由于一般情況下剪切力與肉嫩度呈反比，則可知牛、羊肉的背最長肌嫩度均優(yōu)于腹部肌肉。除此之外，上述研究結(jié)果顯示，羊肉2個部位剪切力差異較牛肉明顯，說明屠宰率最高月齡的羊肉在這2個部位的肉質(zhì)嫩度差異較牛肉明顯。比較同一部位的剪切力發(fā)現(xiàn)，在2個部位肉中，羊肉的剪切力均顯著小于牛肉的(P<0.05)，背最長肌和腹部肌肉分別低6.84% 和4.99%，說明屠宰率最高月齡且相同部位羊肉肉質(zhì)較牛肉更嫩，且牛、羊肉間背最長肌差異較大。

肉的嫩度直接決定著消費(fèi)者的消費(fèi)情況，直接影響著肉的商業(yè)價值[24-26]。而剪切力又是反映肉嫩度的常用指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)背最長肌肌肉的剪切力小于腹部肌肉的，與之前研究[27]結(jié)果一致。有研究[28]通過改變胴體成熟過程所處的環(huán)境溫度而使得肌原纖維蛋白降解、小片化指數(shù)增加來減小剪切力值，最終改善肉的嫩度。因為肌肉蛋白的溶液度也能反映蛋白的降解情況[9]，所以研究發(fā)現(xiàn)羊肉組的肌原纖維溶解度與剪切力均小于牛肉組的，與該結(jié)論一致，但在牛、羊肉組中背最長肌的肌原纖維溶解度小于腹部組的，而腹部的剪切力卻大于背最長肌部位的結(jié)果與上述結(jié)論相悖，所以該結(jié)果還有待進(jìn)一步分析。此外，肉的pH值對其嫩度也有一定的影響。由于pH值的減小降低了肌漿鈣離子激活因子的活力，使得其對肌肉骨架蛋白的降解能力減小，從而肌原纖維小片化指數(shù)減少，肉質(zhì)嫩度變差[29]。這與上述研究發(fā)現(xiàn)羊肉組的pH值大于牛肉組的，但羊肉組的剪切力小于牛肉組的結(jié)果相一致。

不同小寫字母表示同一物種不同部位差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一部位不同物種間差異顯著(P<0.05)

圖3 YH、YL、NH和NL組的剪切力

Figure 3 Shearing force of YH, YL, NH and NL groups after slaughter

2.4 蛋白質(zhì)溶解度

2.4.1 肌漿蛋白溶解度 由圖4可知，背最長肌的肌漿蛋白溶解度均顯著大于腹部的(P<0.05)，分別高出11.23%，8.76%。就同一部位的肌漿蛋白溶解度而言，羊肉組均顯著大于牛肉組(P<0.05)，背最長肌和腹部肌肉分別高出8.23% 和10.68%。在宰后過程中蛋白質(zhì)的溶解度與其降解程度呈正相關(guān)，由此可知，屠宰率最高月齡的牛、羊肉宰后過程中背最長肌的蛋白降解較腹部明顯，且同一部位比較，羊肉在宰后過程中肌漿蛋白的降解程度較牛肉大。

不同小寫字母表示同一物種不同部位差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一部位不同物種間差異顯著(P<0.05)

圖4 YH、YL、NH和NL組的肌漿蛋白溶解度

Figure 4 Sarcoplasmic protein solubility of YH, YL, NH and NL groups after slaughter

2.4.2 肌原纖維蛋白溶解度 由圖5可知，背最長肌的肌原纖維蛋白溶解度均顯著小于腹部的(P<0.05)，分別低5.18%，5.99%。就同一部位的肌原纖維蛋白溶解度而言，羊肉組均顯著小于牛肉組(P<0.05)，背最長肌和腹部肌肉分別低14.16%和13.29%。結(jié)果表明在屠宰率最高月齡階段，牛、羊肉腹部肌肉的肌原纖維蛋白降解程度較背最長肌肌肉的明顯，且同一部位的蛋白溶解度比較發(fā)現(xiàn)，牛肉的蛋白降解程度較羊肉的明顯。

肌漿蛋白與肌原纖維蛋白間也存在相互影響，肌漿鈣離子激活因子中含硫氫基團(tuán)的半胱氨酸殘基作為其活性中心，易氧化而使得部分酶失活，從而減弱了肌原纖維蛋白的水解性，致使肌原纖維小片化指數(shù)減小[30]。這與上述研究結(jié)果，同一部位的牛、羊肉和牛、羊肉的背最長肌和腹部肌漿蛋白溶解度與肌原纖維蛋白溶解度呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相一致。

不同小寫字母表示同一物種不同部位差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一部位不同物種間差異顯著(P<0.05)

圖5 YH、YL、NH和NL組的肌原纖維蛋白溶解度

Figure 5 Myofibrillar protein solubility of YH, YL, NH and NL groups after slaughter

2.5 電泳的結(jié)果

2.5.1 肌漿蛋白的電泳圖 通過SDS-PAGE電泳分析法，詳細(xì)分析蛋白降解情況。由圖6可知，2組肉的電泳條帶差別較小，均在35～40 kDa 呈彌散現(xiàn)象。牛肉組在16～20 kDa 的條帶比羊肉組的多，且亮度較高，該范圍內(nèi)主要蛋白為肌紅蛋白，而肌紅蛋白又直接影響著肉的顏色，這也與上述得出牛肉組的紅度值顯著高于羊肉組的相一致。除此之外，由圖6還可知，在12～13 kDa 內(nèi)，羊肉組的條帶較牛肉組亮，可能是宰后肉成熟過程中羊肉的降解速率及降解程度較牛肉快。

圖6 YH、YL、NH和NL組的肌漿蛋白SDS-PAGE圖譜

Figure 6 SDS-PAGE spectrum of sarcoplasmic protein of YH, YL, NH and NL groups after slaughter

2.5.2 肌原纖維蛋白的電泳圖 由圖7可知，在25～40 kDa 背最長肌的條帶較腹部多，且在35～45 kDa出現(xiàn)了交聯(lián)現(xiàn)象。羊肉組在100 kDa的條帶較牛肉組亮，該分子量大小的蛋白應(yīng)該是肌原纖維蛋白中的主要蛋白——α-輔肌動蛋白。觀察40 kDa左右的條帶發(fā)現(xiàn)，羊肉組的條帶較牛肉組更寬，此分子量大小的蛋白應(yīng)是肌動蛋白(43 kDa)。在25～35 kDa 內(nèi)，羊肉組的條帶數(shù)較牛肉組多，該分子量范圍內(nèi)的蛋白可能是部分肌球蛋白輕鏈。除此之外，羊肉組的小分子條帶較多，說明羊肉在宰后蛋白的降解程度較牛肉明顯。

動物宰后，蛋白的降解情況及其降解后產(chǎn)生的多肽對肉的食用品質(zhì)至關(guān)重要[31-33]。羊肉組中肌漿蛋白的溶解度大于牛肉組可能是牛、羊肉肌漿蛋白的疏水相互作用力存在差異所致，羊肉組中肌肉蛋白的表面疏水性氨基酸的相對含量較高，致使溶解度較大[34-35]。Lin等[35]研究發(fā)現(xiàn)，肌漿蛋白中二硫鍵含量與肉硬度呈正相關(guān)，而二硫鍵含量越高，蛋白肽鏈的空間結(jié)構(gòu)越緊密，溶解度越低，可能是背最長肌和腹部肌肉溶解度存在差異的原因之一，這也與上述肌漿蛋白溶解度與剪切力的關(guān)系相一致。本研究得出背最長肌肌肉的肌原纖維蛋白溶解度小于腹部肌肉的，可能是腹部肌肉所含的肌原纖維蛋白中的肌動蛋白與肌球蛋白易結(jié)合，生成的肌動球蛋白又能很快地降解成小分子量的蛋白，從而使得與水分子的相互作用力加強(qiáng)而出現(xiàn)溶解度差異[36]。牛肉組的肌原纖維蛋白溶解度大于羊肉組的，可能是羊肉中鈣蛋白酶(μ-calpain)活性較牛肉中低，減慢了肌原纖維蛋白聚合和降解速率[9]。

3 結(jié)論

在最適屠宰年齡下，因受剪切力和蛋白降解的影響，橫山羊肉背最長肌和腹部的肌肉均稍嫩于秦川牛肉，二者背最長肌的肉質(zhì)嫩度均優(yōu)于腹部肌肉；橫山羊肉背最長肌和腹部的肌肉色澤均稍亮于秦川牛肉，二者背最長肌肌肉的亮度優(yōu)于腹部；秦川牛肉背最長肌和腹部肌肉較橫山羊肉肉色偏紅，但秦川牛肉2個部位肌肉肉色差異不明顯，而橫山羊肉的背最長肌肌肉較腹部肌肉偏紅；此外，橫山羊肉2部位蛋白降解的降解速率及降解程度較秦川牛肉顯著，這也是其肉質(zhì)較嫩的主要原因之一。本研究僅宏觀地研究了陜西特色牛、羊肉食用品質(zhì)及蛋白穩(wěn)定性間的關(guān)系，因此，后續(xù)研究可通過蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)深入分析具體蛋白及特定的生物通路對宰后不同部位及不同物種間肉品質(zhì)差異的影響，從而為食品企業(yè)肉類加工、儲藏提供一定的理論指導(dǎo)。

圖7 YH、YL、NH和NL組的肌原纖維蛋白 SDS-PAGE圖譜

Figure 7 SDS-PAGE spectrum of myofibrillar protein of YH, YL, NH and NL groups after slaughter