馬莉 蔣思靜 賈大平 趙宇

顆粒脂肪是目前臨床首選的填充移植物，但存在吸收率高、感染及液化等并發(fā)癥。研究表明，在顆粒脂肪移植過程中添加FGF2可誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，以促進(jìn)新生血管形成，提高顆粒脂肪移植存活率[1]，但是單獨(dú)添加FGF2易被組織稀釋，存留時(shí)間短，成本高，難以長期發(fā)揮作用[2]，而FGF2基因治療技術(shù)更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。病毒與脂質(zhì)體由于具有細(xì)胞毒性和致畸性等潛在風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用。殼聚糖具有緩釋、基因載體等多種功能并廣泛應(yīng)用于藥物緩釋劑基因載體的研究。我們前期研究顯示，殼聚糖衍生物巰基烷基化殼聚糖（Thiolated N-alkylated chitosan）可與DNA通過正負(fù)電荷相互作用形成包載基因的核結(jié)構(gòu) （TACS-pEGFP），核結(jié)構(gòu)具轉(zhuǎn)染特性。核結(jié)構(gòu)再與羥丁基殼聚糖（HBC）形成核殼結(jié)構(gòu)（HBC@TACS-pEGFP）。該核殼結(jié)構(gòu)基因載體具有低細(xì)胞毒性、良好的轉(zhuǎn)染效率和緩慢釋放基因等特點(diǎn)[3]。因此，我們?cè)O(shè)想在顆粒脂肪移植過程中添加包埋FGF2基因的緩釋轉(zhuǎn)染核殼結(jié)構(gòu)，以提高顆粒脂肪移植存活率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

新西蘭兔18只，3月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 Kg，雌雄不限（安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；人腎上皮細(xì)胞（293T細(xì)胞）（安徽醫(yī)科大學(xué)免疫教研室）；巰基烷基化羥丁基殼聚糖（TACS）及羥丁基殼聚糖（HBC）（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料與化學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室）；兔源性融合基因pFGF2-EGFP大腸桿菌菌株和空載質(zhì)粒 GV219（上海吉?jiǎng)P生物公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；兔抗 CD31 抗體（Sigma公司，美國）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染載體的制備

體外擴(kuò)增提取質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度后，-20℃保存?zhèn)溆?。按照課題組前期研究結(jié)果，以20∶1的氮磷比，將TACS與pFGF2-EGFP質(zhì)粒混合于PBS緩沖液中，渦旋振蕩30 sec，混勻，室溫下靜置30 min，形成TACS-pFGF2-EGFP質(zhì)粒核結(jié)構(gòu)，再加入與TACS等量的HBC，渦旋振蕩30 sec，混勻，室溫下靜置30 min，即可形成HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結(jié)構(gòu)[3]。

1.3 核殼結(jié)構(gòu)體外降解釋放pFGF2-EGFP實(shí)驗(yàn)

分別制備含 100 μg質(zhì)粒的 TACS-pFGF2-EGFP和HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結(jié)構(gòu)置于透析袋中，將透析袋置于含TE緩沖液中，分別于第1、2、3、5、8、10、15、20 天時(shí)測(cè)定緩沖液中 pFGF2-EGFP的濃度。檢測(cè)核殼結(jié)構(gòu)包載基因相較于核結(jié)構(gòu)包載基因緩釋基因的釋放規(guī)律。

1.4 Western-blot檢測(cè)體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)FGF2蛋白的水平

體外培養(yǎng)人293T細(xì)胞，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)照組：每培養(yǎng)皿中加入含5 μg空載質(zhì)粒（GV219）的HBC@TACS-GV219核殼結(jié)構(gòu)及不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組：每培養(yǎng)皿中加入含5 μg質(zhì)粒的HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼轉(zhuǎn)染載體及不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。分別于轉(zhuǎn)染第2天及第4天時(shí)收集細(xì)胞，Western-blot檢測(cè)各組體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)FGF2蛋白的情況。

1.5 顆粒脂肪移植實(shí)驗(yàn)

新西蘭兔靜脈麻醉，無菌條件下切取肩胛間區(qū)脂肪，剪碎至約1 mm3大小備用。將兔耳皮膚與耳軟骨膜剝離，形成直徑約3 cm的皮下腔隙作為顆粒脂肪移植受區(qū)。兔左耳作為實(shí)驗(yàn)組，移植2 mL脂肪顆粒和HBC@TACS-pFGF2-EGFP；兔右耳作為對(duì)照組，移植2 mL脂肪顆粒和HBC@TACS-空載質(zhì)粒。每組均含質(zhì)粒 20 μg，體積 200 μL。術(shù)畢，縫合皮膚，肌肉注射青霉素預(yù)防術(shù)后感染，單籠飼養(yǎng)。分別于術(shù)后4、8、12周取材觀察大體標(biāo)本，測(cè)量組織體積，行HE染色及免疫組化染色，觀察移植脂肪的成活情況及新生血管情況。

1.6 觀察指標(biāo)

一般觀察：術(shù)后動(dòng)物活動(dòng)及飲食情況，移植后取材區(qū)及移植區(qū)有無感染等情況。移植物大體觀察：分別于術(shù)后第4、8、12周取材，觀察耳部移植物大體組織形態(tài)，計(jì)算移植后不同時(shí)間點(diǎn)的組織存活率。HE染色：觀察移植物脂肪細(xì)胞形態(tài)及新生血管情況。免疫組化：羊抗兔CD31抗體染色，測(cè)量平均光密度值，計(jì)算新生血管密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。術(shù)后組織體積數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核殼結(jié)構(gòu)體外緩釋pFGF2-EGFP質(zhì)粒

TACS-pFGF2在TE緩沖溶液中緩釋24 h后其釋放率約為45.3%，緩釋48 h時(shí)釋放率約為59%；第5天時(shí)，約有86.3%的pFGF2-EGFP被釋放；第10天到第20天時(shí)，TACS-pFGF2-EGFP組的基因釋放率無明顯增高，均在90%左右。而HBC@TACS-pFGF2-EGFP組在各時(shí)間點(diǎn)釋放的基因濃度均低于TACS組。由此可見，TACS在包裹基因后能在短時(shí)間內(nèi)釋放基因，而在TACS外繼續(xù)包裹HBC后增加了載體的降解時(shí)間，減緩了基因釋放的速度（圖1）。

圖1 核殼結(jié)構(gòu)納米粒子體外緩釋實(shí)驗(yàn)Fig.1The release of TACS-pFGF2-EGFP and HBC@TACS-pFGF2-EGFP in the TE buffer in vitro

2.2 HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結(jié)構(gòu)體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)FGF2蛋白的情況

實(shí)驗(yàn)組HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼緩釋基因載體在體外可成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)FGF2蛋白，且隨時(shí)間增加表達(dá)蛋白的量也在增加（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染后第4天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組FGF2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。說明 HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結(jié)構(gòu)基因載體可成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)目的蛋白FGF2，且隨時(shí)間推移蛋白表達(dá)水平逐漸增加（圖2）。

圖2 體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)FGF2蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of FGF2 at different time point after transfection

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)移植物大體觀察

實(shí)驗(yàn)組脂肪體積在不同時(shí)間點(diǎn)均大于對(duì)照組。移植術(shù)后第4周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的脂肪組織仍呈顆粒狀，脂肪顆粒顏色稍蒼白、缺血明顯、無明顯包膜形成，對(duì)照組移植物中央可見少量脂肪無菌性液化。術(shù)后第8周時(shí)，兩組顆粒脂肪移植物體積與第4周相比有所減小，大體結(jié)構(gòu)與正常組織相似，組織顏色淡黃色，質(zhì)地柔軟，未感染或囊性液化。第12周時(shí)，兩組脂肪組織可見完整包膜及大量新生血管，組織體積近一步減小，形態(tài)與正常組織無異（圖3）。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)取材大體標(biāo)本觀察Fig.3 Gross observation of fat harvested at different time point

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)脂肪體積的測(cè)定

結(jié)果顯示，隨移植時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組4、8、12周時(shí)的脂肪移植存活率分別為 （89.50±1.86）%、（79.94±1.61）%和 （75.98±2.66）%；對(duì)照組分別為（72.56±1.90）%、（64.54±3.58）%和 （57.98±4.84）%，各時(shí)間點(diǎn)間差異顯著（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組脂肪移植存活率在各時(shí)間點(diǎn)均大于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.5 HE染色

術(shù)后第4周時(shí)，脂肪組織可見少量纖維包裹，實(shí)驗(yàn)組脂肪排列稍整齊，邊緣區(qū)及中央?yún)^(qū)開始出現(xiàn)少量新生血管；對(duì)照組脂肪細(xì)胞大小不一，排列紊亂，少量炎癥細(xì)胞浸潤，并有纖維條索形成。術(shù)后第8周，實(shí)驗(yàn)組脂肪細(xì)胞排列逐漸整齊，新生血管進(jìn)一步增多；對(duì)照組脂肪組織可見少量空泡，纖維條索進(jìn)一步取代脂肪組織。術(shù)后第12周，實(shí)驗(yàn)組脂肪組織形態(tài)與術(shù)后第8周相比無明顯變化，組織形態(tài)與正常脂肪組織差別不大，并可見大量成熟血管；對(duì)照組脂肪組織內(nèi)見大量纖維條索結(jié)構(gòu)形成（圖4）。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)取材脂肪組織HE染色（100×）Fig.4 Histological observation of adipose tissue at different time point by HE staining(100×)

2.6 免疫組化觀察

移植術(shù)后第4周，實(shí)驗(yàn)組即可觀察到少量CD31蛋白被染成棕色，對(duì)照組棕色顯色不明顯。術(shù)后第8周和12周，實(shí)驗(yàn)組棕色染色逐漸增多。對(duì)照組也可觀察到少量棕色顯色。Image J軟件測(cè)定CD31光密度，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組脂肪組織的CD31平均光密度值均高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨時(shí)間推移CD31的光密度值逐漸增高，說明移植術(shù)后各取材時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組脂肪組織的新生血管密度均高于對(duì)照組（圖 5、6）。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)取材脂肪組織免疫組織化學(xué)染色分析（200×）Fig.5 Histological and immunohistochemical analysis of adipose tissue at different time point by IHC(200×)

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)取材脂肪組織CD31平均光密度值分析Fig.6 The average optical density of CD31of adipose tissue at different time point

3 討論

脂肪移植已成為整形外科的重要部分，但脂肪移植后難以維持其移植時(shí)的初體積。Kolle等[4]研究表明，移植后的高吸收率從25%～80%不等。由于脂肪細(xì)胞對(duì)缺血的耐受性較低，導(dǎo)致部分顆粒脂肪無菌性壞死吸收。脂肪組織的緩慢血運(yùn)化導(dǎo)致早期細(xì)胞凋亡和成熟移植脂肪細(xì)胞壞死。即使移植后再血管化，移植物體積縮小過程仍然存在。

bFGF可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成脂分化和成血管分化，被廣泛用于促進(jìn)脂肪移植存活率的研究[1]。但外源性生物蛋白制劑在進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境后易被組織中的酶代謝降解，無法長期發(fā)揮作用[1]。殼聚糖作為一種天然、低毒性的基因轉(zhuǎn)染材料被廣泛應(yīng)用[5]。本課題組前期成功制備了可作為基因載體的巰基烷基化殼聚糖（TACS），在TACS的量與基因的量比例為20∶1時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)38.99%。我們還制備了具有溫度敏感效應(yīng)的羥丁基殼聚糖 （HBC）包裹基因載體，達(dá)到緩釋基因載體的功效。與傳統(tǒng)的基因載體（如Lip2000等）相比，改性后的殼聚糖作為轉(zhuǎn)染載體能完整包裹基因，具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性[3]。

有研究利用巰基烷基化殼聚糖（TACS）和羥丁基殼聚糖 （HBC）依次包裹 BMP4基因，制成HBC@TACS-pBMP4核殼緩釋轉(zhuǎn)染載體，用于修復(fù)骨缺損，結(jié)果提示在骨缺損修復(fù)過程中，BMP4蛋白持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)了骨缺損的修復(fù)，并且新生骨具有一定的生物力學(xué)特性[6]。說明該核殼緩釋基因載體適用于長期治療過程。

本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了HBC@TACS-pFGF2-EGFP在體外可緩慢降解釋放pFGF2-EGFP基因，而且在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可成功表達(dá)FGF2蛋白。在脂肪移植實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組加入了HBC@TACS-pFGF2-EGFP緩釋轉(zhuǎn)染微球。在術(shù)后取材進(jìn)行脂肪移植存活率計(jì)算中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組脂肪移植存活率在各時(shí)間點(diǎn)均大于對(duì)照組。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組脂肪結(jié)構(gòu)與正常脂肪相似，對(duì)照組脂肪吸收率較高，且被部分纖維組織取代。免疫組織化學(xué)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組可見較多被染成棕色的CD31。由此可見，在顆粒脂肪移植過程中添加含有一定量的緩釋FGF2基因的微球，可長時(shí)間持續(xù)表達(dá)FGF2蛋白，并且促進(jìn)新生血管的形成，降低顆粒脂肪移植過程中的吸收率，提高顆粒脂肪移植存活率。

本實(shí)驗(yàn)在脂肪移植過程中加入pFGF2-EGFP質(zhì)粒，結(jié)果提示脂肪組織存活率較對(duì)照組有所提高，CD31的表達(dá)也顯著增加，由于加入的基因是融合基因，使得所加入的pFGF2基因的量不明確。需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)將EGPF基因切除后探索在移植過程中加入質(zhì)粒進(jìn)行輔助，以提高脂肪存活率的最佳的脂肪體積與基因的比值?；蜣D(zhuǎn)染載體TACS外包被了HBC后可延緩基因作用時(shí)間，如何確定外層HBC的量，使得基因載體釋放速度與脂肪組織移植后所需蛋白的時(shí)效進(jìn)行匹配仍需進(jìn)一步研究。此外，本研究中移植物最長取材時(shí)間為12周，移植后脂肪組織的遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸及生物學(xué)效應(yīng)仍需探索。能否使用該方法進(jìn)一步研究大體脂肪組織的構(gòu)建也需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。