丁大領(lǐng) 吳力新 張風(fēng)江 郭宗澤 龐長(zhǎng)河 劉獻(xiàn)志 孫劍瑞*

(1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052; 2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽110001)

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占腦腫瘤的80%，具有侵襲性并且缺乏有效的治療措施，而對(duì)于高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者的平均生存期一般只有12～15 個(gè)月，雖然手術(shù)及術(shù)后給于輔助治療，但總體療效仍很差[1-3]。人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)屬于皰疹病毒 β 亞科，在人群中廣泛傳播， 病毒感染無季節(jié)性區(qū)別，全年皆可發(fā)生。我國(guó)是世界上 HCMV 感染率最高的國(guó)家之一，在普通人群中感染率80%以上，懷孕婦女原發(fā)或繼發(fā)的 HCMV 感染可造成胎兒畸形、智力低下或發(fā)育遲緩等，嚴(yán)重者甚至可引起巨細(xì)胞包涵體病[4-5]。近年來，關(guān)于HCMV感染和腦膠質(zhì)瘤的研究越來越多，并且存在較大的爭(zhēng)議，本文通過分析人巨細(xì)胞病毒IE1-72蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況并且與患者預(yù)后的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、一般資料

選擇2007年1月至2016年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本89例，其中男55例，女34例，平均年齡(43.8±12.7)歲。對(duì)照組標(biāo)本來自于原發(fā)性癲癇病灶切除術(shù)后腦組織。病理學(xué)診斷依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(2016年)[6]，WHO III級(jí)和Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。所有患者均未接受過放、化療及免疫治療等相關(guān)治療(表1)，所有患者通過電話詢問或定期來院復(fù)查隨訪。隨訪8～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為19個(gè)月。

二、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HCMV IE1-72蛋白的表達(dá)

選取典型的腦膠質(zhì)瘤組織蠟塊進(jìn)行連續(xù)性切片，厚度4 μm，并放入68 ℃烤箱中烘烤20 min。石蠟經(jīng)二甲苯脫蠟和不同濃度的乙醇水化后，3% H2O2室溫孵育10 min，檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)2.5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并血清封閉。每張切片甩去多余血清后滴加50 μL已稀釋鼠抗人IE1-72抗體 (Abcam, ab30924, 濃度為1 ∶ 40)，4 ℃孵育過夜。4 ℃過夜后需在37 ℃復(fù)溫45 min，1×PBS洗3次。生物素標(biāo)記二抗孵育和鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育各20 min，DAB顯色，顯微鏡下控制染色時(shí)間，蘇木素核復(fù)染及返藍(lán)，中性樹膠封片，系統(tǒng)顯微鏡下分析照相。

三、結(jié)果判定

以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性，根據(jù)染色陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度由兩位研究員分別獨(dú)立評(píng)分。每張切片選取5個(gè)不同的高倍視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野進(jìn)行隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞。染色強(qiáng)度評(píng)分(0分為無染色；1分為弱染色，淺黃色；2分為中度染色，黃褐色；3分為重度染色，棕黃色)和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分(0分為陰性0%～1%；1分為陽性細(xì)胞數(shù)2%～25%；2分為陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%；3分為陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%；4分為陽性細(xì)胞數(shù)>75%)。染色指數(shù)=染色強(qiáng)度×染色陽性腫瘤細(xì)胞×比例。在染色指數(shù)評(píng)分大于4分，定義為高表達(dá)，染色指數(shù)評(píng)分小于4分，認(rèn)為低表達(dá)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析HCMV IE1-72蛋白表達(dá)水平與患者年齡、性別、病理級(jí)別的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，HCMV IE1-72蛋白表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤與對(duì)照腦組織之間差異采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，構(gòu)建Cox回歸模型，分析HCMV IE1-72蛋白的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者無進(jìn)展生存期的關(guān)系。采用χ2檢驗(yàn)計(jì)算各組之間的差異，以P<0.05認(rèn)為有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 HCMV IE1-72蛋白在腦膠質(zhì)瘤和對(duì)照腦組織中的表達(dá)情況(免疫組化，×200)

Fig 1 HCMV IE1-72 protein expression in glioma and control brain tissues (IHC, ×200)

A: Astrocytoma (Grade II); B: Astrocytoma (Grade III); C: Glioblastoma tissues; D: Normal human brain tissues.

結(jié) 果

一、HCMV IE1-72蛋白在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)

采用免疫組化方法檢測(cè)89例腦膠質(zhì)瘤組織中和10例對(duì)照腦組織標(biāo)本中HCMV IE1-72蛋白的表達(dá)情況(圖1A～D)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)76.4%的(68/89)膠質(zhì)瘤組織中出現(xiàn)HCMV IE1-72蛋白陽性反應(yīng)，主要位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中，其中75.0%(24/32)Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤、70.9%(22/31)Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤和84.6%(22/26)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中出現(xiàn)陽性表達(dá)，在腫瘤壞死組織及瘤周正常腦組織中無陽性表達(dá)，同時(shí)對(duì)照腦組織標(biāo)本中也沒有HCMV IE1-72蛋白表達(dá)(表1)，HCMV IE1-72蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照腦組織(Z=-4.915,P=0.000)。另外HCMV IE1-72蛋白免疫染色強(qiáng)度與腦膠質(zhì)瘤患者的性別(r=0.059，P=0.586)、年齡(r=0.045，P=0.675)無明顯的相關(guān)性。

二、HCMV IE1-72蛋白表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系

在免疫組化半定量分析中，40.6%(13/32)的II級(jí)星形細(xì)胞瘤，51.6%(16/31)的III級(jí)星形細(xì)胞瘤和53.8%(14/26)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中出現(xiàn)HCMV IE1-72蛋白高度表達(dá)，高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級(jí))細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中有較高的HCMV IE1-72蛋白表達(dá)，但我們發(fā)現(xiàn)HCMV IE1-72蛋白免疫染色強(qiáng)度與腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別(r=0.112，P=0.295)無明顯的相關(guān)性。同時(shí)，不同腦膠質(zhì)瘤組織中HCMV陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度具有較大差異，甚至在同一標(biāo)本的不同染色部位結(jié)果也不相同。

表1 89名腦膠質(zhì)瘤患者的臨床特征和HCMV IE1-72蛋白的表達(dá)情況

Tab 1 Clinical features of 89 patients and the expressions of HCMV IE1-72 protein in glioma

Clinical featureCasesn% Total89 Sex Male5561.8 Female3438.2 Age (years) 10～403134.8 40～605056.2 ≥6089.0 Extent of resection Gross total removal6674.2 Residue<30%2325.8 IE1-72 Positive6876.4 Negative2123.6 Tumor grade Grade Ⅱ3235.9 Grade Ⅲ3134.8 Grade Ⅳ2629.3

三、HCMV IE1-72蛋白表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后關(guān)系

雖然HCMV IE1-72蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中不同程度的表達(dá)，但不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤之間HCMV IE1-72蛋白表達(dá)量無顯著性差異，同時(shí)我們決定評(píng)估在HCMV IE1-72蛋白陽性表達(dá)和無HCMV IE1-72蛋白表達(dá)的兩組膠質(zhì)瘤患者中其預(yù)后結(jié)果是否具有差異性。我們使用Kaplan-Meier生存分析方法，發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤患者中IE1-72蛋白低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的PFS無相關(guān)性(χ2=2.710，P>0.05)。見圖2。

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織中IE1-72蛋白低表達(dá)組和高表達(dá)組Kaplan-Meier生存曲線

Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis chart of IE1-72 protein in glioma tissue of low expression group and high expression group

討 論

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最普遍的惡性腫瘤之一，并且缺乏有效的治療方法[2,6]，在我國(guó)其年發(fā)病率為5/10萬，且發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。腦膠質(zhì)瘤有高度浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的概率相當(dāng)高并難以根治[7]。因此，怎樣有效地抑制腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)已成為研究的熱點(diǎn)。近年來研究顯示，人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系存在較大的爭(zhēng)論[8-13]。

HCMV屬于雙鏈線性結(jié)構(gòu)的β亞科皰疹病毒，大小約為240 kb。HCMV在人群中廣泛傳播，感染無季節(jié)性區(qū)別。我國(guó)是世界上 HCMV感染率最高的國(guó)家之一，我國(guó)成人感染率接近100%。在人類個(gè)體不同發(fā)育時(shí)期，HCMV主要侵染的器官及細(xì)胞不同，在胎兒及新生兒時(shí)期，主要感染神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟上皮細(xì)胞；而在兒童時(shí)期，主要侵染淋巴組織。懷孕婦女原發(fā)或繼發(fā)的 HCMV感染可造成胎兒畸形、智力低下等，嚴(yán)重者甚至可引起巨細(xì)胞包涵體病[4-5,9]。

最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HCMV感染存在于人類多種不同類型的腫瘤組織中，Cobbs CS[8]等人采用免疫組化法對(duì)不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中 HCMV IE1-72抗原的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示抗原陽性率為100%。Mitchell DA[13]等研究發(fā)現(xiàn)， 90%以上的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中可檢測(cè)到 HCMV基因組及其蛋白。Harkins等[14]研究發(fā)現(xiàn)在32例原發(fā)性和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的上皮腫瘤中，運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)到97%出現(xiàn)HCMV IE的表達(dá)。同時(shí)Harkins等[15]也檢測(cè)了來自45份結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺癌患者病變組織、病變相鄰組織及正常黏膜組織的標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺癌患者的HCMV IE1-72抗原檢出率為80%，而對(duì)同一患者腫瘤毗鄰的以及遠(yuǎn)離腫瘤的正常結(jié)腸黏膜的HCMV IE1-72抗原檢測(cè)卻為陰性。盡管如此，HCMV感染與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系目前仍存在較大爭(zhēng)論，部分學(xué)者通過免疫組化、巢式PCR、原位雜交等技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤組織中卻不能檢測(cè)到該病毒的表達(dá)[16-18]。本研究通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)76.4%細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)HCMV IE1-72蛋白陽性表達(dá)，其中75.0% II級(jí)星形細(xì)胞瘤、70.9% III級(jí)星形細(xì)胞瘤以及84.6%膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中出現(xiàn)陽性表達(dá)；但在對(duì)照腦組織標(biāo)本中沒有發(fā)現(xiàn)HCMV IE1-72蛋白陽性表達(dá)，腦膠質(zhì)瘤組織與對(duì)照腦組織的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)，本研究與Mitchell DA、Cobbs CS[8,13]等研究一致。同時(shí)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中HCMV IE1-72蛋白表達(dá)差異性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級(jí))細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中卻有較高的HCMV IE1-72蛋白表達(dá)。這些研究結(jié)果表明了 HCMV 感染在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生影響。但我們通過進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)HCMV IE1-72蛋白表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的PFS無相關(guān)性(P>0.05)。

前期一些研究成果發(fā)現(xiàn)HCMV感染人體后，可以潛伏于宿主的特定細(xì)胞，形成持續(xù)的潛伏感染，與宿主長(zhǎng)期共存并且還可以對(duì)宿主細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲等產(chǎn)生影響[8]。我們認(rèn)為HCMV感染在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用，但HCMV感染對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲的影響是一個(gè)復(fù)雜的過程，本研究可以為理解膠質(zhì)瘤的形成和進(jìn)展機(jī)制提供理論依據(jù)，并可以為治療膠質(zhì)瘤提供新的有效靶點(diǎn)。