高小娥

（武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430074）

人T淋巴細胞表面分布不同的CD分子，其中CD4、CD8在臨床診斷上有重要意義[1-2]。CD4+T淋巴細胞又稱T輔助細胞（成年人的相對值43.8%±9.0%），CD8+T淋巴細胞又稱T抑制細胞（正常成年人相對值31.3%±7.0%），它們的比值（1.5～1.7）：1，可以在一定程度上反映人體的免疫機能。同時，HIV的攻擊對象正是人體的CD4細胞，HIV感染者可以導(dǎo)致機體內(nèi)CD4+T淋巴細胞的絕對數(shù)量減少，CD8+T淋巴細胞數(shù)量增加，CD4+、CD8+的比例失調(diào)，因此，CD4+/CD8+的比值能夠直接反映人體免疫功能，是提供HIV感染患者免疫系統(tǒng)損害狀況最明確的指標[3-4]。國外在20世紀90年代已將CD4+T淋巴細胞計數(shù)和CD4+/CD8+比值測定作為HIV/AIDS的一項重要的診斷依據(jù)，中國從2001年起也將CD4+T淋巴細胞計數(shù)作為HIV/AIDS診斷的一項標準。通常是采用流式細胞術(shù)[5]結(jié)合免疫熒光標記抗體技術(shù)進行計數(shù)和比值的測定。

常用抗體標記的熒光素有PI、PE、FITC、PerCP、CY5等，其中PE是一種分子量極大的藻膽蛋白，由于其天生具有光合作用的分子片段，使其能將所吸收的光能最大限度地傳輸，被廣泛應(yīng)用于標記技術(shù)中[6-7]。PE因其吸收光波長不同分為R-PE（488nm）、B-PE（568nm）、APC（633nm），R-PE的分子量為240kD，激發(fā)波長488～560nm，發(fā)射波長595nm，其激發(fā)波長和發(fā)射波長不同，可以使它易于與FITC及內(nèi)源性熒光分子相區(qū)別，并且能夠在同一激發(fā)波長下，與其他熒光素同時標記檢測不同分子。目前國內(nèi)引進的大多數(shù)流式細胞儀只裝有一個激光光源488nm光源，因此，選用能被488nm光源激發(fā)的R-PE熒光染料作為標記CD4/CD8單克隆抗體的熒光素。

1 材料與方法

1.1 材料

R-PE購自Sigma公司，DTT購自Sigma公司，DEMO購自Sigma公司，SPDP購自Pharmacia公司，SMCC購 自Fluka公 司，N-ethylmaleimide solution購自Fluka公司，CD4/CD8單克隆抗體來自武漢生物制品研究所，AKTAFPLC快速液相色譜系統(tǒng)，TU-1810型紫外分光光度計，等

1.2 實驗方法

1.21 CD4/CD8單抗的純化

采用辛酸-硫酸胺兩步法+疏水層析純化CD4/CD8單克隆抗體，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳證實提純效果好，純度大于95%。

1.2.2 R-PE標記CD4/CD8單克隆抗體

1.2.2.1 R-PE的預(yù)處理與質(zhì)量檢測

將保存在60%硫酸氨中的R-PE（共6mg，約2 mL），充分搖勻后，放入Eppendorf管中，12000r/min離心10min，棄上清。將沉淀重懸于0.5mLPBS中，用Sephadex-G25脫鹽，洗脫液為0.02 mol/LPBS（pH7.5）。取1mL脫鹽后的R-PE，加3mLPBS稀釋，分別用紫外分光光度計測定其在280nm、565nm、620nm的吸光度。

1.2.2.2 R-PE的活化[9]

取 R-PE 3mg (約 2mL)，加入 6 μlSPDP (10mg/mL，溶DEMO中)，使SPDP與R-PE的摩爾比在10～15。室溫孵育80min，加34mgDTT使之終濃度為50mmol/L，室溫攪拌20min，對PBS透析24h。

1.2.2.3 CD4/CD8單抗的活化[10]

調(diào)整CD4/CD8單抗?jié)舛葹?mg/mL取1mL純化后CD4/CD8抗體，加入15 μLSMCC(10mg/mL，溶于DEMO中)，使SMCC與單抗的摩爾比在10～15。室溫孵育80min，對PBS透析24h。

1.2.2.4 CD4/CD8單抗的標記

將活化后的R-PE和活化后的CD4/CD8單抗混合，4℃攪拌過夜。

1.2.2.5 封閉

加入新鮮配制的6mg/mL N-ethylmaleimide solution，室溫反應(yīng)30min。

1.2.2.6 單抗標記物的純化

將標記抗體通過S-300柱在AKTA監(jiān)測下分離純化，0.02mol/LPBS（pH7.5）洗脫，流速為1 mL/min，收集第一峰。

1.2.2.7 單抗標記物的保存

將收集的單抗標記物中加入BSA和疊氮納，使終濃度分別達到1%和0.1%，在4℃避光保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 單抗的純化

用于制備PE標記的單抗要求純度高（≥90%）?？贵w純化一般都采用硫酸銨兩步法、辛酸-硫酸銨兩步法和SPA-Sepharose柱親合層析方法純化。本實驗中采用的是辛酸-硫酸銨兩步法+疏水層析純化CD4/CD8單克隆抗體，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳證實提純效果好，純度大于95%。

2.2 R-PE的質(zhì)量要求

R-PE脫鹽后，用紫外分光光度計在280nm、565nm、620nm的吸光度測定溶液，結(jié)果見表1要求A565/A280≥5.0，A620/A565≤0.02。

表1 吸光度檢測結(jié)果

2.3 單抗標記物過SephacrylS-300柱的圖譜

如圖1所示，交聯(lián)反應(yīng)物共洗脫出3個蛋白峰。Sephaeryl S-300HR的排阻極限Mr 300 000，交聯(lián)物的分子量約為400 000，R-PE的Mr 240 000，單克隆抗體Mr約150 000。根據(jù)篩分原理，交聯(lián)物分子量高于排阻極限，首先洗脫下來。因此峰1是R-PE和CD4/CD8單抗的交聯(lián)產(chǎn)物，峰2是游離而未交聯(lián)的R-PE，峰3是多余的CD4/CD8單克隆抗體。

圖1 抗CD4/CD8 單抗-PE凝膠過濾層析圖

2.4 FACS分析結(jié)果

表2 標記抗體檢測人外周血單個核細胞CD4、CD8表達情況anti-CD4檢測結(jié)果

圖2 FACS分析正常人外周血CD4、CD8細胞圖

如表2所示，標記抗體檢測的CD4和CD8分子在正常人外周血單個核細胞中的比例分別為47.49%、32.73%，符合正常人外周血單個核細胞正常值范圍即CD4為（43.8±9.0）%，CD8為（31.3±7.0）%，且特異性保持完好，熒光強度較高。

3 討論與小結(jié)

3.1 單抗純度對標記結(jié)果的影響

用于制備PE標記的單抗要求純度高(>95%)?？贵w純化一般都采用硫酸銨兩步法、辛酸-硫酸銨兩步法和SPA-Sepharose柱親合層析方法純化。本實驗中采用的是辛酸-硫酸銨兩步法+疏水層析法純化CD4/CD8單克隆抗體，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳證實提純效果好，純度達到96%。

3.2 R-PE和抗體的交聯(lián)比例對標記結(jié)果的影響

R-PE和抗體的交聯(lián)比例也是標記成功與否的關(guān)鍵因素之一，分別采取了1:1、1:2、2:1、3:1四種不同的比例進行交聯(lián)，結(jié)果顯示，R-PE和CD4/CD8單抗在1：1的比例交聯(lián)，其交聯(lián)的抗體特異性保持完好，非特異偶聯(lián)少且熒光強度較高，可重復(fù)性好。

3.3 R-PE的質(zhì)量對標記結(jié)果的影響

R-PE的質(zhì)量在標記中是極為重要的。其保存條件、溫度及使用期限對它的質(zhì)量都有影響。文獻顯示，用于標記的R-PE要求A565/A28≥5.0，A620/A565≤0.02，因此，本實驗在開始之前，對購買的R-PE商品進行預(yù)處理和質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示R-PE經(jīng)檢測 A565/A280=5.2058、A620/A565=0.014，滿足標記要求。

本實驗使用異雙功能交聯(lián)試劑SPDP和SMCC分別活化R-PE和CD4/CD8單克隆抗體，將活化后的R-PE和CD4/CD8單抗以摩爾比1:1的比例交聯(lián)，能得到具有良好熒光強度和特異性的偶聯(lián)單抗，具有一定的普適性，但R-PE和抗體的利用率，即交聯(lián)產(chǎn)率還有待進一步提高。

4 結(jié)論

用于制備標記的單抗純度和R-PE的質(zhì)量，交聯(lián)劑的使用，單抗和R-PE的交聯(lián)比例以及反應(yīng)時間和溫度都對交聯(lián)效果有影響。合理的控制這些條件，就可以提高交聯(lián)效率。