黃強，鄭敏，劉小龍，歐陽滿，黃磊

（江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西上饒 334000）

馬鈴薯cpDNA和mtDNA是核外遺傳系統(tǒng)的主要組成部分[1-2]，與核基因組（nDNA）一起共同控制諸多農(nóng)藝性狀及生理特征[3]，線粒體DNA也編碼一些重要的生物性狀，諸如植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育等。相對nDNA而言，馬鈴薯cpDNA和mtDNA結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化保守，cpDNA呈絕對的單親母系遺傳，mtDNA大多為單親母系遺傳[4]。因此，cpDNA和mtDNA的多態(tài)性是揭示馬鈴薯細(xì)胞質(zhì)遺傳背景，追溯母系祖先，研究馬鈴薯起源與演化的分子基礎(chǔ)[5]。

研究表明，馬鈴薯具有5種類型的cpDNA（T、W、A、C、S）和6種類型的mtDNA（α、β、γ、δ、ε和D），常用cpDNA/mtDNA的不同組合形式（如T/β、W/α、W/γ、A/ε等）和D型mtDNA表示不同的細(xì)胞質(zhì)遺傳背景[6]。T/β是普通栽培種（S.tuberosum L. ssp. tuberosum, 2n=4x=48）細(xì)胞質(zhì)的代表類型[9]；D為墨西哥六倍體野生種（S. demissum）細(xì)胞質(zhì)類型[7]；W/α、W/γ在野生種（Wild species）普遍存在，常用來表示野生種（除S. demissum外）細(xì)胞質(zhì)的代表類型；同樣，A/ε常用來表示安第斯栽培類群（Andigenum Group）的細(xì)胞質(zhì)類型。mtDNA雖不像cpDNA能反應(yīng)馬鈴薯種間親緣關(guān)系，但在體細(xì)胞融合再生植株中易發(fā)生重排或重組，常常導(dǎo)致再生植株擁有與親本不同的性狀[8]。因此，mtDNA多態(tài)性對子代的篩選有重大應(yīng)用價值[9]。

1 試驗材料

1.1 植物材料

所用的馬鈴薯品種均取自于云南師范大學(xué)薯類作物研究所保存的二倍體自交系群體。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：新型植物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司），Taq PCR Mastermix（天根生化科技有限公司），引物T、Alm4/5、D。

儀器：DY-600型電泳儀、My CyclerTM Thermal Cycler型PCR儀；XXPCR儀；BIO-PRO 200E型凝膠成像系統(tǒng)：WFZ UV-2800AH型紫外分光光度儀。

2 實驗方法

2.1 植物DNA的提取

鮮葉片100 mg，參照說明書用新型植物基因組提取試劑盒提取總DNA。

2.2 幾種引物的PCR擴增

2.2.1 引物

試驗中利用的引物有T（葉綠體標(biāo)記）、alm（線粒體標(biāo)記）、D（線粒體標(biāo)記）序列信息見表1。

2.2.2 PCR反應(yīng)體系及擴增條件

引物alm擴增反應(yīng)體系（25 μL）：

引物D擴增反應(yīng)體系（20 μL）：

引物T擴增反應(yīng)體系（20 μL）：

各引物PCR反應(yīng)條件的設(shè)置見表2。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

準(zhǔn)確稱取瓊脂糖，制備1%瓊脂糖凝膠。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取DNA的電泳結(jié)果

加2μL提取物于0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，提取的DNA電泳條帶清晰，無拖尾、彌散，滿足試驗要求，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取DNA電泳結(jié)果

表1 引物序列信息

表2 PCR反應(yīng)體條件

3.2 基因PCR檢測結(jié)果

分子標(biāo)記檢測結(jié)果如表3所示。在引物alm4/5的體系中，有 5、14、16、18、20、21、23、57、67和72的樣品中未見擴增產(chǎn)物，其他樣品中均有擴增產(chǎn)物。在引物T1/2的體系中，所有樣品中均有擴增產(chǎn)物。在引物D的體系中均未見擴增產(chǎn)物。

4 小結(jié)

本實驗通過對葉綠體和線粒體DNA的多態(tài)性分析，揭示了來自c品系的96份馬鈴薯的細(xì)胞質(zhì)遺傳多樣性，初步分析相同品系間的細(xì)胞質(zhì)遺傳共性和差異。結(jié)果表明，該品均說明擴增出T型條帶，96份材料均和普通栽培種有親緣關(guān)系，86份材料中擴增出A型條帶，所占比例為89.6%，說明大部分材料和安第斯栽培種存在著親緣關(guān)系；檢測的D型條帶在96份材料中均無擴增條帶的出現(xiàn)，說明該系列的品種和野生品種無親緣關(guān)系。

表3 分子標(biāo)記檢測結(jié)果