徐雄，寧衛(wèi)紅，瞿志榮，楊瑞卿，謝永榮＊

（1.贛南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西省高校功能材料化學(xué)重點實驗室，江西贛州 341000；2.杭州師范大學(xué)有機硅化學(xué)及材料實驗室，浙江杭州 311121）

手性是自然界及生命過程的基本特征之一[1]。自從反應(yīng)停致畸事件以來，手性藥物引起了人們的廣泛關(guān)注，與此同時，手性藥物對映體的拆分引起了人們的重視[2-14]。據(jù)統(tǒng)計，目前臨床常用的藥物中約有60%具有手性結(jié)構(gòu)[15]，而對于一些手性藥物來說，能夠產(chǎn)生藥理作用的多為其中的一種對映體，而另外一種對映體無藥理作用甚至產(chǎn)生顯著的副作用。此外，手性藥物所產(chǎn)生的藥理活性與其手性特征密切相關(guān)，藥物對映體在生物體內(nèi)一般表現(xiàn)出不同的藥理活性、代謝過程和毒理作用[16-17]。目前，臨床上的手性藥物要求使用光學(xué)純的對映異構(gòu)體，以確保藥物的安全性。因此，研究藥物對映體的拆分具有重要的實用價值。

現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，促進了藥物對映體拆分技術(shù)的發(fā)展。高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法以及超臨界流體色譜法等是常用的儀器分析方法[18-26]，其中高效液相色譜法以分離效率高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快和對各種分析物具有通用性等優(yōu)點，備受研究人員喜愛，被認為是用于手性物質(zhì)分析分離最有效的方法[27]。

高效液相色譜分離手性物質(zhì)一般采用兩種方法：直接法和間接法。間接法（即手性衍生化法）分離是利用手性衍生化試劑與樣品反應(yīng)形成非對映異構(gòu)體，然后在非手性柱上進行分離。柱效高、價格便宜是該法的優(yōu)點；但耗時且操作復(fù)雜，對手性試劑的純度、反應(yīng)過程中的穩(wěn)定性等要求較高。直接法分離使用手性固定相或手性流動相添加劑分離手性物質(zhì)，因其操作簡便及分離優(yōu)勢而得到優(yōu)先使用。然而，直接法分離中的手性固定相法因其條件的限制而不能被廣泛使用，如需要昂貴的手性柱以及嚴格的立體定向性等。相比之下，使用手性流動相添加劑的方法分離物質(zhì)具有更明顯的優(yōu)點，（1）常規(guī)的非手性柱和普通流動相即可實現(xiàn)分離，成本相對較低；（2）操作簡便，拆分效果好；（3）可選擇的手性添加劑種類多，范圍寬，應(yīng)用廣；（4）可以用于制備光學(xué)純藥物。因此，HPLC手性流動相添加劑法為對映體分離提供了靈活的選擇。手性流動相添加劑法是拆分藥物對映體最便利有效的方法之一[28-30]，其拆分原理是在流動相中添加某種手性試劑，該手性試劑與對映體溶質(zhì)之間通過氫鍵、離子鍵、配位鍵或者空穴的包含作用等相互作用，形成非對映異構(gòu)體，然后根據(jù)非對映異構(gòu)體自身的穩(wěn)定性及其在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同，從而實現(xiàn)對映體的拆分。

1 手性添加劑的種類及其拆分原理

1.1 環(huán)糊精類化合物

利用環(huán)糊精類化合物作為流動相手性添加劑是通過環(huán)糊精的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)對藥物對映體的包含作用，形成不同理化性質(zhì)的手性包含物，使其在流動相和固定相中產(chǎn)生不同的分配系數(shù)，實現(xiàn)對映體的拆分。常用的環(huán)糊精化合物有β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）、三甲基-β-環(huán)糊精（TM-β-CD）、羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）以及磺丁基醚-β-環(huán)糊精（SBE-β-CD）等，已應(yīng)用于拆分腎上腺素的前藥鹽酸地匹福林[31]、鹽酸替羅非班[32]、肌肉松弛藥美索巴莫[33]、鎮(zhèn)靜催眠藥佐匹克隆[34]、抗抑郁藥西酞普蘭[35]、非甾體抗炎藥阿卓乳酸[36]，β-腎上腺受體阻斷劑美托洛爾和多巴胺再攝取抑制劑文拉法辛[37]、鹽酸去甲苯福林[38]等。

1.2 手性金屬配合物

手性試劑與金屬離子形成的手性金屬配合物，加入色譜流動相中，與拆分藥物的對映體作用，形成兩個非對映體配合物，它們與固定相發(fā)生立體選擇性吸附和排斥作用不同，從而產(chǎn)生色譜的分離。常用的手性金屬配合物中手性試劑通常是光學(xué)活性的氨基酸及其衍生物。它們適用于拆分氨基酸、羥基羧酸及其衍生物等。例如，L-脯氨酸、L-苯丙氨酸以及L-酒石酸及其衍生物，易于與過渡金屬Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Cd2＋等離子配位，形成手性金屬配合物，已大量用于拆分鹽酸莫西沙星[39]、氧氟沙星[40]、苯丙氨酸和色氨酸[41]、鄰氯扁桃酸[42]、色氨酸[43]、扁桃酸衍生物[44]和甲狀腺素[45]等。

1.3 手性離子對試劑

在色譜流動相中，加入能與藥物對映體離子形成非對映體離子對的光學(xué)純試劑，即手性離子對試劑。常用的手性離子對試劑有奎寧、奎尼丁、N-芐氧羰基-S-苯基-L-半胱氨酸甲酯、10-樟腦磺酸、N-苯甲酰氧基羰基-甘氨酸-L-脯氨酸和酒石酸衍生物等顯堿性或酸性的試劑。手性離子對試劑的手性中心附近含有可離子化的官能團，在低極性的有機流動相中，與藥物對映體分子產(chǎn)生靜電作用或疏水性反應(yīng)而生成非對映體離子對，非對映體離子對具有不同的穩(wěn)定性，在流動相與固定相之間的分配行為有差異，進而差速遷移得以分離。手性離子對試劑已用于拆分普萘洛爾，苯丙醇胺、美托洛爾、腎上腺素和沙丁胺醇對映體[46-47]、胺類藥物[48]等。

1.4 手性氫鍵試劑

手性氫鍵試劑是指能與藥物對映體形成氫鍵，產(chǎn)生藥物的非對映體，而得以分離物質(zhì)。例如，N，N-二甲基-L-苯丙氨酸、N-乙?；?L-纈氨酸-四丁酰胺等經(jīng)過修飾的氨基酸和二肽類，它們已用于拆分左旋多巴[49]、巴比妥類、氨基酸及其衍生物、氨基醇等[50-51]，它們通過在非極性或低極性的流動相中與藥物對映體產(chǎn)生氫鍵作用來分離藥物對映體。

2 流動相手性添加劑用于藥物對映體拆分時的影響因素

不同的手性添加劑及濃度、流動相的pH與流速、柱溫和有機改性劑等都對手性藥物的拆分有影響，在具體應(yīng)用中應(yīng)不斷試驗與探索，才能獲得最佳拆分效果。

2.1 不同的手性添加劑及濃度的影響

不同的手性添加劑具有不同的拆分原理，適用于不同結(jié)構(gòu)的手性藥物的拆分。通常一個有效的手性流動相添加劑，需要經(jīng)過大量試驗才能獲得。翟明翚等[31]利用環(huán)糊精（β-CD）、羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）和羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）拆分鹽酸地匹福林，獲得較好的試驗結(jié)果。上述三種手性流動相添加劑各自的拆分效果如圖1所示，可見羧甲基-β-環(huán)糊精才能獲得基線分離鹽酸地匹福林對映體的目的（圖1c）。

圖1 不同的手性添加劑拆分鹽酸地匹福林譜圖[31]

CM-β-CD不同濃度拆分鹽酸地匹福林的效果如圖2所示?？梢?，隨著CM-β-CD濃度的增加，分離度R于增大后減小，說明手性添加劑的濃度對藥物對映體的拆分有影響，不同的濃度可能會改變分子間的作用力。然而整體上不同濃度范圍內(nèi)的CM-β-CD對鹽酸地匹福林均有拆分效果，說明選取合適的手性添加劑對化合物的手性拆分的重要性。

圖2 手性添加劑濃度對分離度的影響

2.2 流動相不同的pH值及流速的影響

對帶有酸性或堿性基團的藥物分子，流動相的pH對其對映體的拆分有較大的影響，在不同酸堿條件下，對化合物對映體的分離具有非常顯著的影響。翟明翚等[33]報道了用CM-β-CD手性流動相添加劑拆分美索巴莫對映體的試驗結(jié)果，圖3展示了不同流動相pH值對美索巴莫左右旋體拆分的影響。可見，隨著流動相pH值的增大，對映體拆分的分離度呈現(xiàn)拋物線變化，這是因為美索巴莫分子在不同的pH值下具有不同的電離狀態(tài)（圖4所示），美索巴莫呈現(xiàn)出不同的分子結(jié)構(gòu)，與CM-β-CD產(chǎn)生出不同的作用力，使非對映體包合物得到速差遷移，實現(xiàn)拆分目的。

圖3 流動相pH值對美索巴莫左右旋體拆分的影響

圖4 美索巴莫的電離平衡反應(yīng)

流速對美索巴莫左右旋體拆分的影響如圖5所示?？梢?，當流速較快時，CM-β-CD與藥物對映體分子形成的二個非對映體包合物在固定相上吸附的時間較短，遷移差異小，分離效果降低。但流速慢，出峰時間長，峰形變寬，色譜峰拖尾嚴重，拆分效果也變差。因此不同的流速對其拆分呈現(xiàn)不同的分離效果和分離度，選取合適的中等流速能夠?qū)崿F(xiàn)化合物的有效拆分。

圖5 流速對美索巴莫左右旋體的拆分的影響

2.3 柱溫的影響

色譜柱溫的改變會影響流動相中各分子的運動速率和解離狀態(tài)，從而影響藥物對映體與手性流動相添加劑的作用原理，產(chǎn)生拆分效果的差異。張虎等[36]報道了用手性流動相添加劑磺丁基醚-β-環(huán)糊精（SBE-β-CD）拆分阿卓乳酸對映體的研究。圖6展示了柱溫對拆分效果的影響。可見，隨著柱溫的升高，阿卓乳酸對映體的分離度逐漸減小，拆分效果變差。這可能是隨著柱溫的升高，阿卓乳酸對映體與手性流動相添加劑SBE-β-CD的作用發(fā)生了改變，非對映體復(fù)合物穩(wěn)定性降低，色譜行為差異縮小，使拆分效果降低。

圖6 柱溫對阿卓乳酸對映體拆分效果的影響

通常柱溫越高，色譜保留時間越短，拆分效果越差；柱溫越低，保留時間越長，色譜峰變寬，分離度也下降，拆分效果越差，且柱溫過低會導(dǎo)致柱壓升高，損害色譜柱。所以，選擇合適的柱溫在藥物對映體拆分應(yīng)用中也很重要。

2.4 有機改性劑的影響

二元或多元溶劑系統(tǒng)組成的流動相，通常用有機溶劑作為改性劑，調(diào)節(jié)流動相的極性，改善色譜的峰形和平滑度，提高藥物對映體的分離效能。翟明翚等[38]選用了甲醇或乙腈作為有機改性劑，研究了用CM-β-CD手性流動相添加劑拆分鹽酸去甲苯福林對映體的效果，圖7展示結(jié)果表明：甲醇-水、乙腈-水、以及甲醇-乙腈-水三種不同組成的溶劑系統(tǒng)組成的流動相，拆分鹽酸去甲苯福林對映體的效果不同，其中甲醇-水系統(tǒng)組成的流動相未達到拆分藥物對映體的效果，乙腈-水系統(tǒng)只實現(xiàn)部分對映體的拆分，而甲醇-乙腈-水系統(tǒng)，能實現(xiàn)對映體的基線分離?？梢?，不同有機改性劑組成的流動相對藥物對映體的拆分效果也影響很大。

圖7 有機改性劑的選擇及比例對分離度的影響

有機改性劑的作用大小與其本身的溶解性、pH值、極性以及黏度有關(guān)。通常拆分酸性藥物對映體選擇酸性有機改性劑，拆分堿性藥物對映體選擇堿性有機改性劑。常用的有機改性劑有甲醇、乙腈、三乙胺以及緩沖鹽溶液等。

3 結(jié)語

手性流動相添加劑法是重要的對映體拆分方法之一，具有操作簡便、效率高、消旋化少、添加劑的選擇范圍寬等特點。能夠應(yīng)用于各種類型的手性藥物的拆分試驗。隨著分析技術(shù)的不斷進步，相信會有越來越多的手性藥物拆分技術(shù)開發(fā)，手性流動相添加劑法拆分藥物對映體技術(shù)也可以得到較大的發(fā)展。