譚君 牟云 周光普 周永順 徐杰 高劍峰

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003）

資源、能源和環(huán)境是當(dāng)前人類社會(huì)發(fā)展面臨和必須解決的三大難題。目前，我國(guó)能源短缺，形勢(shì)嚴(yán)峻，石油等化石能源儲(chǔ)備嚴(yán)重不足，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足經(jīng)濟(jì)和社會(huì)高速發(fā)展的需要，迫切需要從戰(zhàn)略角度發(fā)展新的可再生能源［1］。微藻已被作為重要的可再生能源資源，并已經(jīng)有許多研究報(bào)道了有關(guān)微藻的生物學(xué)特性。例如，運(yùn)用雙向電泳技術(shù)（2-DE）、研究了集胞藻（Synechocystissp. PCC 6803）的蛋白質(zhì)［2］， 不同濃度 NaCl脅迫下魚腥藻（Anabaena doliolum）蛋白質(zhì)組學(xué)差異［3］以及紡錘形馬尾藻在鎘脅迫下的蛋白質(zhì)組分的差異［5］。利用2-DE、Western-blot等技術(shù)研究熱休克蛋白在逆境中誘導(dǎo)表達(dá)并證實(shí)了chaperonin 家族的一員HSP60蛋白可通過(guò)熱激的方式進(jìn)行誘導(dǎo)［7］。通過(guò)挑選單克隆及多克隆抗體來(lái)分析強(qiáng)壯前溝藻（Amphidinium carterae）膜骨架中兩種不同類型的骨架蛋白［8］。此外， Song等［4］研究了在正常和缺氮組球等鞭金藻在油脂積累過(guò)程中的蛋白組學(xué)變化。Simon等［6］通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定了聚胞藻的192種可溶性蛋白。

綜上可知，國(guó)內(nèi)外有關(guān)微藻蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已有較大的突破，這不僅提高了人們認(rèn)識(shí)微藻及其生命過(guò)程的能力，也促進(jìn)了微藻生物柴油制備的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。與高等植物相比，有關(guān)微藻抗逆的蛋白組學(xué)研究就相對(duì)滯后；并且有關(guān)微藻蛋白組學(xué)研究大多集中在海洋藻類，對(duì)于沙漠藻類的干旱脅迫蛋白組學(xué)研究還未見報(bào)道。本研究基于前期建立了沙漠小球藻蛋白質(zhì)組雙向電泳體系［9］，以小球藻為研究對(duì)象，改進(jìn)研究方法，從蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究干旱脅迫下小球藻的蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn)，旨在為探索沙漠小球藻應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)，為沙漠微藻制備生物柴油的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用藻種（Chlorellasp.）由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從新疆塔克拉瑪干沙漠沙樣中分離、純化并鑒定。將藻種接種于BBM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，取活化后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液以10%的接種量分別接種至BBM液體培養(yǎng)基和PEG6000添加量為20%的BBM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4 000 lx，12 h光照，溫度為23℃。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取和定量試驗(yàn) 采用Trisol法［9-10］提取蛋白質(zhì)。取適量培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液4℃6 000 r/min離心5 min，所得藻泥用ddH2O清洗3次，得鮮藻泥；經(jīng)液氮研磨，裝入1.5 mL離心管中，加入1 mL Trisol試劑，震蕩混勻，室溫靜置5 min；加入200 μL氯仿，充分混勻后靜置5 min，4℃ 12 000r/min離心15 min；棄上層無(wú)色液體后加入300 μL無(wú)水乙醇懸浮下層深紅色液體，4℃ 12 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入1 mL異丙醇混勻，靜置20 min以沉淀蛋白，4℃ 12 000 r/min離心10 min，沉淀用95%乙醇清洗后空氣中干燥，待蛋白表面光滑后加入一定比例的裂解液溶解蛋白（干粉5 mg：50 μL），于30℃水浴中孵育2-4 h；4℃12 000 r/min離心30 min，所得上清液即為蛋白溶液。采用2D Quant Kit［10］定量蛋白質(zhì)。分別制備干旱后0、6、12、18、24和30 d的沙漠小球藻全蛋白，備用。

1.2.2 雙向電泳檢測(cè) 雙向電泳體系為24 cm IPG膠條水化上樣量450 μg，在泡脹盤中對(duì)膠條進(jìn)行過(guò)夜被動(dòng)泡脹后，使用Ettan IPGphor3等電聚焦儀進(jìn)行第一向等電聚焦，程序設(shè)定為100 V 2 h；300 V 3 h；1 000 V 3 h；3 000 V 3 h；8 000 V 3 h；8 000 V，分別聚焦600 000 Vh、70 000 Vh、80 000 Vh；500 V，任意時(shí)間。分兩步平衡，每次15 min（平衡液Ⅰ含6 mol/L尿素、2%SDS、75 mmol/L Tris-HCL（pH8.8）、20% Glycetol（甘油）、0.0002% 溴酚藍(lán)和 1%DTT，平衡液Ⅱ含6 mol/L尿素、2%SDS、75 mmol/L Tris-HCL（pH8.8）、20% Glycetol（ 甘 油 ） 和 2.5%Lodacetamide（碘乙酰胺）。使用EttanDaltSix垂直板電泳系統(tǒng)，采用厚度為1 mm 12.5%SDS-PAGE分離膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE蛋白電泳。按照以上方法對(duì)干旱脅迫后0、6、12、18、24和30 d的蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳［9-10］。以 AgNO3染色法染色［11］。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，以獲得穩(wěn)定的差異電泳圖譜。

1.2.3 差異蛋白的篩選 使用ImageScannerⅢ對(duì)圖像進(jìn)行掃描，并用Labscan軟件進(jìn)行照相，圖像分辨率300 dpi；用ImageMaster Platinum 7.0對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)與匹配及差異表達(dá)量的比較后，將表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)2倍以上的蛋白點(diǎn)視作表達(dá)量差異點(diǎn)，經(jīng)ANOVA分析（P＜0.05）且重復(fù)性較好的蛋白差異點(diǎn)。

1.2.4 質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 從凝膠上挖去差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，委托上海生工生物工程股份有限公司完成膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析；將得到的肽質(zhì)量指紋圖提交到Mascot（www.matrixscience.com）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索參數(shù)設(shè)定如下：（1）Database：NCBInr；（2）species：Green plants；（3）Enzyme hydrolysates：Trypsin；（4）Fixed modification：Carbamidomethyl（C）；（5）Variable modification：Acetyl（Protein N-term）、Deamidated（NQ）、Dioxidation（W）、Oxidation（M）；（6）Peptide segment deviation：100 ppm［9］。 符 合質(zhì)譜要求的蛋白質(zhì)序列在Gene ontology數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://amigo1.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi）進(jìn)行功能分類。

1.2.5 差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析 根據(jù)小球藻NA64數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST鑒定所獲得的差異表達(dá)蛋白。用Agri GO進(jìn)行Gene Ontology（GO）注釋和富集分析［12］，用OBAS進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集分析［13］。對(duì)沒(méi)有獲得GO注釋的蛋白，于文獻(xiàn)搜索和蛋白質(zhì)同源物手動(dòng)注釋。因單一工具分類并不能完全詮釋蛋白質(zhì)的功能，研究參照Bevan等［14］的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分類。用STRING v10進(jìn) 行protein-protein interaction（PPI）網(wǎng)絡(luò)互作分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)之間的關(guān)系［15］，使用Cytoscape 2.8.3對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行編輯［16］。

2 結(jié)果

2.1 沙漠小球藻雙向蛋白質(zhì)電泳分析

基于前期的宏觀生理指標(biāo)和轉(zhuǎn)錄組組學(xué)的研究結(jié)果，沙漠小球藻在干旱脅迫后0、6、12、18、24和30 d存在較大的差異，其中第18天沙漠小球藻生長(zhǎng)情況和油脂的合成明顯的升高。因此，以20%PEG 6000模擬干旱處理沙漠小球藻，選取0、6、12、18、24和30 d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)干旱脅迫這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行全蛋白的提取并使用蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳（圖1），在干旱脅迫后0、6、12、18、24和30 d，分別檢測(cè)到（1 098±21）、（1 033±19）、（1 036±32）、（1 026±22）、（1 021±16）、（1 030±25）個(gè)蛋白點(diǎn)，同一處理的3塊重復(fù)膠之間蛋白點(diǎn)的匹配率高達(dá)90%。

采用ImageMaster Platinum 7.0軟件分析干旱脅迫0、6、12、18、24和30 d的小球藻蛋白組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)有32個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的蛋白點(diǎn)（圖2）。其中豐度上調(diào)的有12個(gè)（點(diǎn)3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、24及29），豐度下調(diào)的有12個(gè)（ 點(diǎn) 2、10、11、12、13、14、15、16、23、25、31及32），豐度先下調(diào)后上調(diào)的有8個(gè)（點(diǎn)1、8、9、17、26、27、28及 30）。采用 ImageMaster Platinum 7.0軟件對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析，差異蛋白相對(duì)表達(dá)量按Vol%提取，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3）。

2.2 差異表達(dá)蛋白的鑒定和功能分類

采用MALDI-TOF-MS對(duì)32個(gè)表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均具有差異顯著性，其中豐度上調(diào)的有12個(gè)，豐度下調(diào)的有12個(gè)，豐度先下調(diào)后上調(diào)的8個(gè)，通過(guò)MASCOT軟件對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定，獲得29個(gè)蛋白點(diǎn)（表1）。

圖1 沙漠小球藻蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖2 不同時(shí)間的干旱脅迫條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

質(zhì)譜分析確定的32個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的身份，涉及29個(gè)差異蛋白。GO功能分析（圖4）表明，獲得的差異表達(dá)蛋白參與的生物過(guò)程主要有應(yīng)激反應(yīng)（Response to stress，GO：0006950）和小分子代謝過(guò)程（small molecule metabolic process，GO：004-4281）；細(xì)胞組成主要有線粒體（Mitochondrion，GO：0005739）和類囊體（thylakoid，GO：0009579）；分子功能主要有離子結(jié)合（GO：0043167）和氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity，GO：0016491）。

KEGG途徑富集分析（圖5）表明，獲得的差異表達(dá)蛋白主要參與光合作用、氧化磷酸化、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）等途徑。

根據(jù)差異表達(dá)蛋白序列在Gene ontology中功能分析的結(jié)果，按參與生物代謝過(guò)程被分為7類：物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白（13.79%）、能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白（10.34%）、光合作用相關(guān)蛋白（10.34%）、抗逆相關(guān)蛋白（6.89%）、轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白（6.89%）、抗氧化相關(guān)蛋白（3.45%）和其他未知功能蛋白（48.28%）（圖6-A）。

圖3 差異蛋白的相對(duì)表達(dá)量

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)分析

PPI分析結(jié)果（圖6-B）顯示，部分表達(dá)差異蛋白構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多中心互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)含19個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，有19種互作關(guān)系，各差異表達(dá)蛋白質(zhì)間通過(guò)多條通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，相互作用較強(qiáng)的蛋白質(zhì)主要為光合作用、物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量生成與轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝及抗逆等相關(guān)的蛋白。

圖4 差異表達(dá)蛋白的GO分析

3 討論

本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究干旱脅迫下沙漠小球藻蛋白表達(dá)特點(diǎn)。對(duì)獲得的29個(gè)差異表達(dá)蛋白分析表明，干旱脅迫影響了沙漠小球藻的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，其中光合作用、物質(zhì)代謝和能量合成受到的影響最大，此外抗逆、抗氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程也受到影響。

3.1 光合作用相關(guān)蛋白

葉綠體是光合作用的重要場(chǎng)所，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（點(diǎn)1）是高等植物和藻類中類囊體膜上接收太陽(yáng)能最終同化CO2的一類蛋白，其通常與葉綠素和葉黃素形成捕光色素蛋白復(fù)合體［17］。綠色植物中大部分的葉綠素分子都被光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)II（PSII）上的天然捕光色素復(fù)合體結(jié)合，其中光系統(tǒng)II捕光色素復(fù)合體的含量最為豐富。有研究表明，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白不僅可以行使光能傳遞、轉(zhuǎn)化和分配的功能，其在適應(yīng)環(huán)境脅迫中也起到了重要的作用［18-19］，并且其表達(dá)受ABA信號(hào)調(diào)控［20］。Fan等［21］通過(guò)雙向電泳技術(shù)研究了耐鹽植物海蓬子在高鹽條件下的蛋白組學(xué)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于PSI和PSII上的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的表達(dá)量均明顯上調(diào)。NADPH：醌還原酶（點(diǎn)11）能夠還原多種電子受體，具有NADPH的底物特異性。本研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下一個(gè)捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明脅迫條件一定程度上提高了光合系統(tǒng)的光合能力，促進(jìn)機(jī)體的物質(zhì)代謝，從而來(lái)抵抗干旱脅迫。干旱、高鹽等脅迫會(huì)導(dǎo)致植物機(jī)體受到損傷，高等植物和藻類能通過(guò)多種途徑減少這種損傷。光捕獲復(fù)合物的調(diào)節(jié)就是一種有效的光保護(hù)途徑。NADPH：醌還原酶（點(diǎn)11）能夠還原多種電子受體，具有NADPH的底物特異性。核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶（點(diǎn)31）不僅能在光合作用中固定CO2，還能催化二磷酸核酮糖加氧反應(yīng)［22］。Agrawal等［23］發(fā)現(xiàn)水稻幼苗在臭氧脅迫下，核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶表達(dá)受到抑制。本研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下該蛋白的表達(dá)量下調(diào)，其抗旱機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

表1 沙漠小球藻響應(yīng)干旱脅迫差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖5 差異表達(dá)蛋白的KEGG分析

3.2 物質(zhì)代謝和抗逆相關(guān)蛋白

核酮糖磷酸異構(gòu)酶（點(diǎn)8）是參與碳水化合物代謝和其他有機(jī)復(fù)合物生成的一類重要酶。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，點(diǎn)20）不僅催化二羥丙酮磷酸（DHAP）轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸，也催化3-磷酸甘油醛（GAP）轉(zhuǎn)化為1，3-二磷酸甘油酸；是生物體內(nèi)糖酵解和糖異生過(guò)程中的關(guān)鍵酶［24］，也是維持生命基本活動(dòng)的酶之一。同時(shí)，GAPDH還具有抵抗外界逆境脅迫的功能，Khanna等［25］研究干旱脅迫下鷹嘴豆GAPDH等基因的表達(dá)，結(jié)果表明干旱脅迫下GAPDH表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高；Ahsan等［26］運(yùn)用雙向電泳技術(shù)研究了砷脅迫下水稻葉片的蛋白組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)砷脅迫下GAPDH的表達(dá)量上調(diào)2倍以上。本研究中發(fā)現(xiàn)此蛋白表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明GAPDH可使植物體內(nèi)新陳代謝加快，從而提供更多的能量抵御外界脅迫環(huán)境。烏頭酸水合酶（點(diǎn)21、22）參與三羧酸循環(huán)，可催化檸檬酸和異檸檬酸之間的相互轉(zhuǎn)化。

脅迫環(huán)境下，富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白2（GRP2，點(diǎn)17）是一種植物首先參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的響應(yīng)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)GRPs的表達(dá)可受干旱、高鹽、植物激素等因素的誘導(dǎo)［27-28］。本研究中GRP2在干旱脅迫下先下調(diào)后上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明干旱脅迫誘導(dǎo)該蛋白的表達(dá)。熱休克蛋白60（HSP60，點(diǎn)29）屬于熱休克蛋白家族，其作為分子伴侶廣泛分布于線粒體中，主要參與蛋白質(zhì)折疊、移位和降解等過(guò)程，對(duì)抑制細(xì)胞凋亡也有重要作用。該蛋白在細(xì)胞處于應(yīng)激條件時(shí)（如熱休克、高鹽及干旱等）表達(dá)量明顯提高［29-31］。Sato等［32］在研究水稻抗寒性時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白的上調(diào)表達(dá)。本研究中干旱脅迫下該蛋白的表達(dá)量上調(diào)，可能是因?yàn)槠渑c變性蛋白質(zhì)結(jié)合形成聚合體從而而減少對(duì)小球藻的傷害。

干旱脅迫條件下，核酮糖磷酸異構(gòu)酶這類基礎(chǔ)代謝有關(guān)酶的表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶、烏頭酸水合酶的表達(dá)量上調(diào)。說(shuō)明脅迫條件下小球藻的新陳代謝速度加快，將儲(chǔ)備的能量及時(shí)轉(zhuǎn)化為各種細(xì)胞活動(dòng)所需的動(dòng)力，從而使機(jī)體正常生長(zhǎng)以抵御外界脅迫。

圖6 沙漠小球藻差異蛋白的功能分類（A）與蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（B）

3.3 能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白

ATP合成酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜、葉綠體類囊體和細(xì)胞核中，參與氧化磷酸化和光合磷酸化反應(yīng)，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的推動(dòng)下催化合成ATP，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶，又稱三磷酸腺苷合成酶［33］。本研究鑒定的蛋白點(diǎn)5為ATP合成酶相關(guān)蛋白，其表達(dá)量在干旱脅迫下上調(diào)，為各類代謝活動(dòng)提供能量。ATP依賴的鋅金屬蛋白酶FTSH5（點(diǎn)28）具有ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侶活性，還與熱激、高鹽、病害等脅迫響應(yīng)有關(guān)［34］。Zhang等［35］從磷酸化蛋白組水平探究了干旱脅迫對(duì)兩種小麥的影響，結(jié)果表明干旱脅迫下兩種小麥的ATP依賴的鋅金屬蛋白酶FTSH 5表達(dá)均下調(diào)。Das等［36］在研究大豆葉片對(duì)干旱脅迫及熱激的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白在2種脅迫下的表達(dá)均下調(diào)。本研究中也發(fā)現(xiàn)此蛋白表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)，但對(duì)于其在沙漠小球藻中油脂積累機(jī)制中的作用有待進(jìn)一步的探究和驗(yàn)證。分子伴侶TCP-1/cpn60（點(diǎn)30）主要在ATP水解時(shí)幫助蛋白質(zhì)的折疊和組裝，本研究中干旱脅迫能誘導(dǎo)分子伴侶TCP-1/cpn60表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)可能是因?yàn)槠鋮⑴c了小球藻干旱脅迫相關(guān)蛋白的折疊與組裝，并與小球藻干旱脅迫相關(guān)蛋白的合成密切相關(guān)。

3.4 轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗氧化相關(guān)蛋白

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白（點(diǎn)3）通過(guò)水解ATP產(chǎn)生的能量對(duì)溶質(zhì)中各種生物分子（如氨基酸、蛋白質(zhì)、糖等）進(jìn)行跨膜運(yùn)輸［37］。干旱脅迫條件下，該蛋白的表達(dá)上調(diào)，組織中的糖類、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸可能受到抑制，其抗旱機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。外膜蛋白/肽聚糖結(jié)合（脂）蛋白（點(diǎn)4）具有為外膜提供通透性，維持外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。小球藻可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，從而抵御干旱脅迫。

硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶PMP20（點(diǎn)13）在進(jìn)化中高度保守，從低等原核生物到高等生物人類中均有表達(dá)。該蛋白具有過(guò)氧化物酶和分子伴侶的雙重性能，不僅可以參與細(xì)胞內(nèi)抗氧化物代謝，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［38］。研究發(fā)現(xiàn)，其在不同物種中都可以發(fā)揮抗逆特性來(lái)維持體內(nèi)氧化還原平衡。本研究中干旱脅迫條件下其表達(dá)量下調(diào)，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

除以上具有已知信息的蛋白外，2-DE中檢測(cè)的差異蛋白中有53.13%的未知功能蛋白，主要因?yàn)樾∏蛟宀粚儆谀Ｊ街参铮涞鞍讛?shù)據(jù)庫(kù)還不完善。而其中必定蘊(yùn)藏著和抗旱脅迫相關(guān)的蛋白和基因，這將是以后具有研究?jī)r(jià)值的方向。

3.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)的整體調(diào)控機(jī)制

在PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，具有19個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)。干旱脅迫下差異表達(dá)的蛋白中，光合作用有關(guān)蛋白、能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和抗逆相關(guān)的蛋白普遍上調(diào)。說(shuō)明干旱脅迫影響了葉綠體、線粒體，其干旱的核心是葉綠體結(jié)構(gòu)和光合作用的維持。此外，其他的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)的蛋白也發(fā)生了變化，這些蛋白的變化說(shuō)明沙漠小球藻可以通過(guò)細(xì)胞中各細(xì)胞器的協(xié)同變化以應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

3.6 干旱脅迫下沙漠小球藻蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果比較

本課題組此前已對(duì)干旱和鹽脅迫下沙漠小球藻開展了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，兩者都顯示脅迫18天比第0天脅迫得到的差異表達(dá)基因/蛋白數(shù)量更多，基因/蛋白在功能分類上差異較大。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，大量的蛋白質(zhì)定位在葉綠體中，轉(zhuǎn)錄研究也發(fā)現(xiàn)了光合作用相關(guān)基因。在GO分析中，細(xì)胞組分的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因在葉綠體中明顯富集。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白、能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和光合作用相關(guān)蛋白數(shù)目最多，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中次生代謝物的生物合成、生物過(guò)程調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程和油脂的合成富集最多。兩種方法在研究結(jié)果上的差異反映研究水平不同，合二者獲得的數(shù)據(jù)，從不同水平、不同角度為沙漠小球藻抗逆機(jī)制的研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

干旱脅迫影響沙漠小球藻部分蛋白的表達(dá)，共獲得29個(gè)差異表達(dá)蛋白，主要涉及光合作用、物質(zhì)代謝和抗逆、能量生成與轉(zhuǎn)化等相關(guān)蛋白。沙漠小球藻能夠通過(guò)改變不同功能蛋白的表達(dá)來(lái)維持光合作和脂質(zhì)代謝的過(guò)程，以適應(yīng)干旱脅迫。