蘇茹月 丁萍 商巾杰

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023）

線(xiàn)粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生ATP的場(chǎng)所，是細(xì)胞的“動(dòng)力車(chē)間”，是一種半自主復(fù)制細(xì)胞器。粟酒裂殖酵母線(xiàn)粒體基因組能夠編碼25種tRNA、8種 mRNA、2種 rRNA 及 1個(gè) rnpB［1］。線(xiàn)粒體與人類(lèi)健康有密切的聯(lián)系，線(xiàn)粒體受損會(huì)引發(fā)諸如癌癥，糖尿病，Leigh綜合征，帕金森，嬰兒猝死綜合征等一系列疾病［2-4］，大約有30%-40%的線(xiàn)粒體疾病是由于線(xiàn)粒體呼吸鏈酶缺陷［5-7］造成的，因此有關(guān)線(xiàn)粒體的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

線(xiàn)粒體復(fù)合體 V（ATP 合酶）分為 F1（α3β3γδε）和F0組分。粟酒裂殖酵母數(shù)據(jù)庫(kù)Pombase預(yù)測(cè)Atp11（SPAC3A12.12）是 F1-ATP酶的伴侶蛋白，參與ATP合酶的組裝。粟酒裂殖酵母中Atp11具有兩個(gè)同源蛋白，分別是芽殖酵母中的ATP11和人中的Atp11p。芽殖酵母中ATP11參與F1的組裝蛋白，其中ATP11的缺失在非發(fā)酵型培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長(zhǎng)呼吸受損，這是由于線(xiàn)粒體F1組裝缺陷導(dǎo)致的［8］。并且免疫共沉淀和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明ATP11與F1中β亞基的結(jié)合位點(diǎn)在Gly114和Leu318核苷酸結(jié)構(gòu)域之間［9］。Δatp11突變體中除了ATPase的含量減少，還降低了細(xì)胞色素氧化酶和輔酶QH2-細(xì)胞色素c還原酶的濃度［10］。在人中Atp11p是管家蛋白，參與F1-ATPase的組裝并結(jié)合β亞基位點(diǎn)［11］。研究表明Atp11p保護(hù)胰島素B鏈免于在體外聚集，因此充當(dāng)分子伴侶［12］。ATPAF1是兒童患有哮喘病的易感基因，同時(shí)患有阿爾茨海默病的患者樣品中ATP合酶的量相對(duì)于正常群體中明顯減少［13］。因此，ATP11與線(xiàn)粒體功能有著密不可分關(guān)系。

芽殖酵母中ATP11的功能已經(jīng)研究的比較透徹，但粟酒裂殖酵母中Atp11的功能還沒(méi)有被報(bào)道。因此，本研究旨在探究粟酒裂殖酵母中Atp11參與線(xiàn)粒體功能的機(jī)制，為進(jìn)一步研究粟酒裂殖酵母線(xiàn)粒體蛋白的功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381；大腸桿菌E.coliTop10；質(zhì)粒pFA6ahphMX6，pYJ19（圖1）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 pFA6a-hphMX6及pYJ19圖譜

1.1.2 培養(yǎng)基 YES培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，3%葡萄糖，4種微量元素（adenine、histidine、uracil和leucine），固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉；YES+3%甘油或YES+6%甘油：將YES培養(yǎng)基中的葡萄糖替換成甘油；YES+hph（潮霉素）：YES固體培養(yǎng)基添加潮霉素至終濃度為100 mg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基EMM-leucine（100 mL）：potassium hydrogen phthalate 0.3 g，Na2HPO4·12H2O 0.555 g，NH4Cl 0.5 g，1 000 × vitamin 1 mL，10 000 × mineral stock 0.01 mL，50 × salt stock 2 mL，Agar Powder 2 g，glucose 2 g；3種微量元素：adenine、histidine和uracil各22.5 mg。其中g(shù)lucose分開(kāi)滅菌以防止碳化。

1.1.3 主要試劑 PrimeSTAR高保真聚合酶等PCR反應(yīng)試劑、限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物由上海英駿生物有限公司合成；DNA Marker購(gòu)自南京百思凱；DNA純化試劑盒以及割膠回收試劑盒購(gòu)自博巧生物科技公司；SDS、HEPES、Sorbitol、Tris、30%丙烯酰胺購(gòu)自上海生工。

1.1.4 主要儀器 PCR儀；臺(tái)式高速離心機(jī)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)；電泳槽。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 粟酒裂殖酵母atp11基因序列來(lái)源于酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（S.pombe_GeneDB，http://www.pombase.org/）；粟酒裂殖酵母 Atp11及其人的同源蛋白Atp11p的序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；芽殖酵母中同源蛋白ATP11的序列來(lái)源于SGD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.yeastgenome.org/）；利用NCBI Protein BLAST進(jìn)行蛋白序列同源性比對(duì)分析；用MitoProt II（http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）分析線(xiàn)粒體信號(hào)肽。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.3 載體構(gòu)建及鑒定atp11-del-hphMX6重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以野生型菌株yHL6381基因組為模板，以Atp11-up及Atp11-down為引物分別擴(kuò)增得到atp11的基因5′端上游同源臂（528 bp）和3′端下游同源臂（533 bp），分別將其構(gòu)建在載體pFA6a-hphMX6（圖1-A）的SalI/SmaI和SacI/SpeI位點(diǎn)，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

Atp11-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以野生型菌株yHL6381基因組為模板和pYJ19-GFP為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到atp11基因目的片段，將其構(gòu)建到載體pYJ19（圖1-B）的PstI/SalI位點(diǎn)上，從而實(shí)現(xiàn)在C端添加GFP標(biāo)簽，并進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.4 酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化［14］及菌株鑒定 以atp11-del-hphMX6重組質(zhì)粒為模板，Atp11-up的正向引物和Atp11-down的反向引物為引物，擴(kuò)增目的片段，通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化導(dǎo)入yHL6381菌株中，并在YES+hph（潮霉素）抗性平板上篩選；重組質(zhì)粒Atp11-GFP經(jīng)NruI線(xiàn)性化，獲得目的片段，醋酸鋰轉(zhuǎn)化導(dǎo)入yHL6381菌株中，涂布于EMM-leucine平板上；目的片段通過(guò)同源重組的方法整合在酵母基因組上。菌株鑒定：以yHL6381基因組和挑取的醋酸鋰轉(zhuǎn)化子基因組為模板，再以Atp11-yz為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證；Atp11-GFP菌株通過(guò)熒光顯微鏡觀察進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 Δatp11突變體表型研究 挑取yHL6381菌株和Δatp11突變體于YES液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，將細(xì)胞依次按10倍梯度稀釋?zhuān)謩e點(diǎn)至YES，YES+3%甘油，YES+6%甘油平板上，30℃恒溫培養(yǎng)5 d，拍照。

1.2.6 GFP熒光定位實(shí)驗(yàn) 接種Atp11-GFP菌株于EMM-leucine液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收菌。用1×PBS洗滌兩次之后，在30℃與10 μmol/L MitoTracker染料孵育1-2 min；制片，觀察。

1.2.7 Western blotting 提取yHL6381和Δatp11菌株的線(xiàn)粒體［15］，通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜。用抗體檢測(cè)：一抗：anti-Cob1（1/1 000），anti-Cox1（1/2 000），anti-Cox2（1/300），anti-Cox3（1/300），anti-Atp6（1/2 000），anti-Hsp60（1/2 000，作為內(nèi)參）。二抗：IRDye800CW羊抗兔抗體。Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒驗(yàn)證與菌株鑒定

以野生型基因組yHL6381為模板擴(kuò)增atp11基因的上游同源臂和下游同源臂大小分別為528 bp和533 bp（圖2-A）；重組質(zhì)粒atp11-del-hphMX6和Atp11-GFP構(gòu)建成功（圖2-B-D）。

同源重組的結(jié)果為在裂殖酵母基因組上抗性篩選標(biāo)記hph潮霉素基因（1651 bp）替代了atp11（861 bp）基因，PCR驗(yàn)證結(jié)果（圖3-A）顯示Δatp11突變體構(gòu)建成功。另外，Atp11-GFP菌株在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，說(shuō)明Atp11-GFP菌株構(gòu)建成功（圖3-B）。

圖2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

圖3 敲除菌Δatp11和Atp11-GFP的驗(yàn)證

2.2 Δatp11突變體在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上表現(xiàn)生長(zhǎng)受損

為了研究Atp11的生物學(xué)功能，通過(guò)構(gòu)建Δatp11突變體，在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基中來(lái)培養(yǎng)yHL6381和Δatp11菌株。結(jié)果（圖4）表明，一方面，在以葡萄糖為碳源的YES培養(yǎng)基上，yHL6381和Δatp11突變體生長(zhǎng)狀態(tài)一致，此時(shí)，它們可以利用葡萄糖進(jìn)行無(wú)氧呼吸，不依賴(lài)于線(xiàn)粒體。另一方面，在以甘油為碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基上，相比于野生型菌株，Δatp11敲除菌的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制。這是由于在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上，細(xì)胞只能進(jìn)行有氧呼吸，依賴(lài)于線(xiàn)粒體產(chǎn)生ATP。因此Atp11對(duì)于線(xiàn)粒體功能是必不可少的。

2.3 熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明Atp11定位于線(xiàn)粒體

atp11基因缺失之后影響了線(xiàn)粒體功能，暗示Atp11蛋白很有可能進(jìn)入線(xiàn)粒體行駛功能。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，Atp11的N端有一段由31個(gè)氨基酸殘基組成的線(xiàn)粒體定位序列（MLPIWKLPVNHLLCHSFKSIPRT），可信度高達(dá)90.61%。

圖4 Δatp11在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

利用線(xiàn)粒體染料來(lái)確定Atp11的定位，線(xiàn)粒體marker MitoTracker Red 是一種用于染活細(xì)胞線(xiàn)粒體的染料，在熒光顯微鏡Red通道下發(fā)出紅色熒光。Atp11-GFP能夠表達(dá)綠色熒光蛋白，在GFP通道下發(fā)綠色熒光。如圖5 所示，同一視野中綠色熒光和紅色熒光重疊后發(fā)出橙色熒光，這就證實(shí)Atp11確實(shí)定位在線(xiàn)粒體，結(jié)合前期表型實(shí)驗(yàn)，再次證實(shí)Atp11蛋白與線(xiàn)粒體功能密切相關(guān)。

圖5 Atp11-GFP的熒光顯微鏡觀察

2.4 Atp11對(duì)線(xiàn)粒體基因組編碼蛋白穩(wěn)態(tài)水平有影響

通過(guò)Western blotting技術(shù)檢測(cè)atp11缺失之后對(duì)線(xiàn)粒體基因組編碼的蛋白穩(wěn)態(tài)期水平的影響。結(jié)果（圖6）顯示Δatp11突變體中，Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白水平相對(duì)于野生型菌株顯著降低，Δatp11突變體中幾乎沒(méi)有mt-DNA編碼蛋白質(zhì)的殘留。Cox1、Cox2和Cox3參與組成呼吸鏈復(fù)合體IV，Atp6參與組成復(fù)合體V。線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝受損，導(dǎo)致Δatp11突變體不能在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上正常的進(jìn)行氧化磷酸化，從而表現(xiàn)出呼吸缺陷的生長(zhǎng)狀態(tài)。因此，Atp11對(duì)線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體亞基的組裝是必需的，對(duì)線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的發(fā)揮起重要作用。

圖6 Western blotting檢測(cè)Δatp11菌中線(xiàn)粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)量

3 討論

線(xiàn)粒體呼吸鏈包含多種線(xiàn)粒體呼吸鏈酶，如NADH脫氫酶、琥珀酸氧化還原酶、細(xì)胞色素c還原酶、細(xì)胞色素c氧化酶和ATP合成酶。Cob1由細(xì)胞色素c還原酶編碼，Cox1、Cox2和Cox3由細(xì)胞色素c氧化酶編碼，而Atp6則由ATP合成酶編碼。線(xiàn)粒體呼吸鏈酶經(jīng)過(guò)一系列的氧化還原過(guò)程最終形成ATP，為肌體提供能量。如果線(xiàn)粒體呼吸鏈酶合成受損，將會(huì)引起線(xiàn)粒體功能缺陷，從而引發(fā)線(xiàn)粒體相關(guān)疾病。

已知芽殖酵母中敲除ATP11會(huì)在非發(fā)酵型培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長(zhǎng)呼吸受損現(xiàn)象。通過(guò)蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)芽殖酵母中的ATP11蛋白與裂殖酵母中的Atp11同源性約為38%。因此，本研究在粟酒裂殖酵母中構(gòu)建Δatp11菌株，發(fā)現(xiàn)Δatp11在非發(fā)酵培養(yǎng)中表現(xiàn)出呼吸鏈?zhǔn)軗p生長(zhǎng)；進(jìn)一步研究得出Atp11定位于線(xiàn)粒體中，從而推測(cè)Atp11可能與線(xiàn)粒體基因組編碼蛋白有關(guān)。通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)證明了Atp11會(huì)影響Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白穩(wěn)態(tài)水平。雖然在Δatp11菌中蛋白的穩(wěn)態(tài)水平顯著降低了，但Atp11是影響這些蛋白的轉(zhuǎn)錄、合成還是蛋白的穩(wěn)定，有待進(jìn)一步研究。

另外，芽殖酵母ATP11主要序列分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域：括線(xiàn)粒體前導(dǎo)序列（殘基1-39），N端結(jié)構(gòu)域（NTD，殘基40-111），功能結(jié)構(gòu)域（殘基 112-183）和C末端結(jié)構(gòu)域（殘基184-318）。Atp11功能結(jié)構(gòu)域位于苯丙氨酸-120和天冬氨酸-174序列之間，并且這段功能結(jié)構(gòu)域?qū)κ蔷S持線(xiàn)粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是非常重要的［16］。而裂殖酵母中的Atp11p含有一個(gè)ATP超家族結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是否對(duì)線(xiàn)粒體中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起作用目前還不清楚。接下來(lái)可以通過(guò)設(shè)計(jì)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究Atp11p在線(xiàn)粒體中發(fā)揮的作用。

4 結(jié)論

粟酒裂殖酵母atp11基因大小為861 bp，共編碼286氨基酸殘基。本文主要研究芽殖酵母ATP11的同源蛋白Atp11。敲除atp11構(gòu)建突變體菌株，發(fā)現(xiàn)Δatp11在非發(fā)酵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出呼吸缺陷型生長(zhǎng)，說(shuō)明Δatp11菌是線(xiàn)粒體功能缺陷菌。通過(guò)熒光定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出Atp11定位于線(xiàn)粒體中，這進(jìn)一步說(shuō)明Atp11是在線(xiàn)粒體中發(fā)揮作用。最后，Western blotting實(shí)驗(yàn)證明了Atp11的缺失會(huì)導(dǎo)致復(fù)合體III的Cob1、復(fù)合體IV的部分亞基Cox1，Cox2，Cox3、復(fù)合物V中的Atp6的蛋白表達(dá)水平顯著降低。復(fù)合體亞基組裝受阻導(dǎo)致線(xiàn)粒體呼吸功能受損而引發(fā)在甘油培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)。