蘇初連 康浩 梅志棟 楊石有 劉曉妹 蒲金基 張賀

（1海南大學熱帶農(nóng)林學院，海口 570228；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海口 571101；3 澄邁縣農(nóng)業(yè)局，澄邁 571900）

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）廣泛分布在熱帶和亞熱帶區(qū)域，侵染芒果、香蕉、橡膠、荔枝等多種植物，引起葉部和果實炭疽病。病菌以分生孢子侵染寄主的嫩葉、嫩梢、花、果等部位，引起落葉、落花、落果，以及貯藏期的果實腐爛［1-2］。目前，防治芒果炭疽病的方法主要為化學防治，但隨著化學農(nóng)藥的大量施用，許多地區(qū)的芒果炭疽病菌出現(xiàn)不同程度地耐藥性或抗藥性，如代森錳鋅在芒果園內的長期使用，增加了病原菌對藥劑的選擇壓［3-4］；丙環(huán)唑的長期使用使眾多作物產(chǎn)生抗藥性［5］，多菌靈［6］、甲基硫菌靈［7］、苯醚甲環(huán)唑［8］、咪鮮胺［9］等農(nóng)藥也是如此。田間芒果炭疽病成為生產(chǎn)中較為難防治的病害之一，為更好地解決該問題，有必要從分子水平上探究芒果炭疽病的致病機理，尋找新的農(nóng)藥靶標位點，為開發(fā)新型農(nóng)藥提供參考。

通過分析病原菌侵染寄主過程中基因的差異表達，可以較好地辨析出致病相關基因在侵染過程中的作用［10-12］。膠孢炭疽菌致病相關基因主要調控孢子萌發(fā)，附著胞的形成、黑化、穿透，活體與死體營養(yǎng)階段的轉換及相關蛋白分泌，酶活性及產(chǎn)孢等。如，漆酶基因LAC1在菌絲生長、發(fā)育、分化、黑色素沉淀，以及分生孢子的形成，對寄主的致病力、對環(huán)境的適應能力等方面起著重要的調控作用［13］。

本實驗以芒果炭疽病菌的PL（果膠裂解酶，Pectase Lyase）、PG（ 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶，Endopolygalacturonas-F）、ECH（烯酰-coA水合酶/異構 酶 蛋 白，EnoyL-coA-hydratase/isomerase-F）、LIP（分泌脂肪酶，Secretory lipase-F）、PKS（聚酮合成酶，Polyketide synthase-F）、SCD（小柱孢酮脫水酶，Scytalone dehydratase）、CRAT（肉毒堿乙酰轉移酶，Carnitine acetyl transferase-F）、HMT（組蛋白甲基轉移酶，Histone methyltransferase）、SIN3P（組蛋白脫乙酰酶，Histone deacetylase）、NRPS（非核糖體多肽合成酶，Nonribosomal peptide synthetase-F）和MEP2（銨轉運蛋白mep2，Ammonium transporter mep2-F）等11個致病相關基因為研究對象，通過實時熒光定量PCR，分析致病相關基因在病原菌侵染葉片和果實過程中的表達量變化，揭示芒果炭疽病菌侵染過程中致病相關基因的差異表達，辨析出各個侵染階段的致病相關基因，旨在為后續(xù)基因功能解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芒果炭疽病菌由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)植所提供。供試材料貴妃芒的嫩葉和成熟果，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院品資所芒果苗圃。

E.Z.N.A.? Fungal RNA Kit 購于 Omega 生物技術公司、熒光定量PCR試劑盒UltraSYBR Mixture（Low Roe）購于康為世紀生物科技有限公司、反轉錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購于天根生化科技有限公司，其它試劑均為常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 病原菌接種葉片和果實 參考張賀等［14］人的方法制備芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）A2的分生孢子懸浮液，使其濃度為4×106個/mL，用于接種芒果嫩葉和成熟果。

用清水將貴妃芒的嫩葉、成熟果實沖洗干凈，然后浸泡在1% NaClO溶液中15 min，再用超純水沖洗3遍后置于保鮮盒中，保持相對濕度為100%，備用。

采用束針刺傷嫩葉和成熟果實表皮，接種20 μL分生孢子懸浮液，28℃下恒溫黑暗培養(yǎng)，以接菌0 h的為對照。用直徑為1 cm的打孔器取10個接種點，按照不同的時間點取樣后至于液氮速凍、-80℃保存、備用。

接種葉片后的取樣時間點：0 h、6 h、12 h、24h、36 h、48 h、72 h；接種果實后的取樣時間點：0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 和 96 h。

1.2.2 病原菌總RNA的提取和cDNA第一鏈的反轉錄 參照E.Z.N.A.? Fungal RNA Kit中的方法提取不同時間點的病原菌總RNA，參照Fast Quant RT Kit（with gDNase）試劑盒完成第一鏈cDNA的合成，反轉錄后的cDNA稀釋10倍，備用。采用超微量紫外分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳兩者相結合的方法檢驗總RNA的提取效果，確保RNA的提取質量滿足實驗需要。

1.2.3 實時熒光定量PCR 以病原菌PL、PG、ECH、LIP、PKS、SDH、CRAF、HMT、SIN3P、NRPS和MEP211個致病相關基因為對象，以ACT作為內參基因，所用基因引物序列參考Alkan等［15］，由北京華大生物科技有限公司合成，PAGE純化，詳細引物序列見表1。

實時熒光定量PCR反應體系為20 μL：ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL， 引 物 各 0.5 μL，2×UltraSYBR Mixture 10 μL，檢測系統(tǒng)為 Quant Studio 6 Flex。

PCR反應程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃1 min，72℃ 30 s，40個循環(huán)；16℃保存，在72℃時收集熒光信號。

表1 供試引物序列

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)計算［16］，實時熒光定量PCR儀（QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System Software）系統(tǒng)導出各樣品的Ct值，以接菌0 h的為對照，以基因表達量增加2倍以上為上調，降低50%為下調。參考Deng等［17］的方法，采用HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖，研究分析各致病相關基因在不同組織的侵染過程中的表達差異情況。

2 結果

2.1 病原菌侵染葉片時相關基因表達量分析

病原菌侵染嫩葉時，11個致病相關基因的表達量差異明顯，PL、PG在整個侵染過程中持續(xù)高效表達、各個時間點的表達量高于0 h的5倍以上，PKS、NRPS、MEP2、HMT、ECH、SDH、LIP和CRAT等8個基因在接種6 h 后明顯上調表達，隨后則不同程度地下調表達，僅CRAT在24 h時、HMT和LIP在72 h時的表達量達2倍以上；SIN3P基因則持續(xù)下調表達（圖1）。

圖1 病原菌侵染葉片時基因差異表達的熱度圖

以病原菌侵染葉片時的不同基因不同時間點的基因表達量的兩兩差異程度進行層級聚類分析，結果表明，11個基因共聚為3個大的分支，持續(xù)性高效表達的PG和PL基因聚為1個分支，表達量較低的SIN3P、PKS、NROS和ECH4個基因聚為一個分支，介于二者之間的其余5個基因聚為1個分支，這說明表達量相近的基因會聚類在同一個分支上。

2.2 病原菌侵染果實時相關基因表達量分析

病原菌侵染成熟果時，11個致病相關基因的表達量差異明顯，PL、PG、SDH和ECH基因高效表達、各個時間點的表達量高于0 h的3倍以上，其他基因則有不同程度的上調表達（圖2）。

圖2 病原菌侵染果實時基因差異表達的熱度圖

以病原菌侵染果實時的不同基因不同時間點的基因表達量的兩兩差異程度進行層級聚類，結果表明，11個基因共聚為2個大的分支5個小的分支，持續(xù)高效表達的PL、PG、SDH、ECH基因聚為1個大分支，其中PG和PL聚為1個小分支，ECH和SDH聚為1個小的分支，說明4個基因雖持續(xù)上調表達，但仍有所差異；SIN3P和PKS基因分別單獨聚為一個小的分支，SIN3P僅在12 h和48 h是上調表達，表達量分別為13.34和2.62倍，96 h為下調表達，其余3個時間點的表達量介于1.10-1.89倍之間，PKS在12 h、24 h、48 h和72 h上調表達，表達量分別為4.92、15.22、16.35和46.49倍，36 h的為0.68倍，96 h為下調表達。

3 討論

病原菌在侵染寄主的過程中，會調控自身的致病相關基因進行高效表達，從而調控分生孢子或菌絲朝著有利于自身侵染的方向生長，實現(xiàn)病原菌的順利侵染，造成寄主感病。分析致病相關基因在侵染過程中的差異表達，可為揭示基因功能提供借鑒，也可為施加藥劑阻礙致病基因的高效表達、降低病原菌的侵染效率提供參考。Alkan等［15］在研究膠孢炭疽菌侵染番茄果實的過程中發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶基因PG和果膠裂解酶基因PL在侵染過程中持續(xù)高效上調表達，這與本文研究發(fā)現(xiàn)芒果膠孢炭疽菌侵染葉片和果實時PG和PL持續(xù)性地高效上調表達，具有很好的一致性，這兩個基因能降解寄主細胞壁中的果膠，促使其成功地定殖于寄主內，其單基因突變或雙基因突變均能明顯地降低病原菌的致病力［16］。ECH基因則是先上調再下調的表達方式［17］，與本文結果有差異；PKS基因在膠孢炭疽菌侵染番茄果實時為下調表達，而本實驗中PKS基因的表達方式為先上調再下調表達，與Alkan等［18］的研究結果有所不同。

附著胞在膠孢炭疽菌的侵染過程中起到重要的作用，黑色素的合成積累能增加附著胞的膨壓，從而促進病原菌的成功侵染，而小柱孢酮脫水酶SCD基因則是黑色素合成途徑中的多個關鍵酶之一［19-20］，該基因表達活性的強弱會影響到膠孢炭疽菌的侵染效率。本研究發(fā)現(xiàn)小柱孢酮脫水酶（SDH）在病原菌接種葉片6 h時、接種果實12 h是上調表達，而這個時期則是病原菌分生孢子侵染的時期［21］，這說明小柱孢酮脫水酶SCD參與了分生孢子侵染寄主的過程中。氰菌胺（Fenxanil）和環(huán)丙酞菌胺（Carpropamid）［22-23］是以小柱孢酮脫水酶為靶標的殺菌劑，通過阻斷脫水步驟而限制黑色素DHN的合成，從而抑制病原菌的侵染，但針對不同的病原菌，其殺菌效果差異較大，鑒于SDH在膠孢炭疽菌侵染芒果葉片和果實種發(fā)揮重要作用，有必要對氰菌胺（Fenxanil）和環(huán)丙酞菌胺（Carpropamid）優(yōu)化，而得到殺菌效果更好的殺菌劑，應用于芒果炭疽病的防治過程中。

4 結論

芒果膠孢炭疽菌侵染芒果葉片和果實過程中，病原菌的PL、PG、ECH、LIP、PKS、SDH、CRAF、HMT、SIN3P、NRPS和MEP2等11個致病相關基因的表達量發(fā)現(xiàn)明顯變化。病原菌侵染葉片時，PG和PL基因均持續(xù)高效表達，SIN3P基因表達較低，其余基因在侵染6 h時表達量較高，隨后下降；病原菌侵染果實時，PL、PG、SDH和ECH等基因高效表達，其余基因則有升有降。