王慶偉，徐振雷

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.燒傷整形科，江蘇淮安 223001)

乳腺癌在女性中是發(fā)病率很高的腫瘤，并且其發(fā)病率逐年上升，得益于治療手段的綜合運(yùn)用和治療水平的提高，近年來(lái)乳腺癌患者的預(yù)后得到較大的改善，但仍不容樂(lè)觀，因此尋求乳腺癌新的治療手段迫在眉睫，近年來(lái)生物學(xué)標(biāo)志物和功能基因一直是乳腺腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白F1(FOXF1)是肺發(fā)育和肺損傷/修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已有研究在有肺靜脈錯(cuò)位的肺泡毛細(xì)血管發(fā)育不良患者中發(fā)現(xiàn)FOXF1基因位點(diǎn)雜合缺失或點(diǎn)突變，此疾病是罕見(jiàn)的先天性疾病，其特點(diǎn)是肺泡毛細(xì)血管網(wǎng)嚴(yán)重發(fā)育缺陷[2-3]。FOXF1的異常表達(dá)與結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)[4-6]。目前，F(xiàn)OXF1在乳腺癌中的研究很少[7]，本研究擬觀察乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)水平，并且研究乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 139對(duì)乳腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織的芯片為上海芯超生物科技有限公司產(chǎn)品，包括完整的臨床病理資料，如年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)染色和隨訪資料等信息。

1.2儀器與試劑 免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自上海吉泰生物科技有限公司，鼠抗人FOXF1抗體購(gòu)自美國(guó)西格瑪(sigma)公司，兔抗鼠二抗及鼠抗人鈣黏附蛋白E(E-cadherin)、鈣黏附蛋白N(N-cadherin)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3方法 免疫組織化學(xué)檢測(cè)：芯片經(jīng)10%的甲醛固定后使用乙醇脫水，石蠟包埋后采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(SP)法染色，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格控制染色過(guò)程，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，每次試驗(yàn)用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：將組織切片放置在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和評(píng)分，并且進(jìn)行病理圖像采集。FOXF1主要定位在細(xì)胞核中，綜合高倍鏡下染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行陰陽(yáng)性判斷[8]。染色強(qiáng)度方面，基本未著色評(píng)分為0分，著色為淡黃色評(píng)分為1分，著色為棕黃色評(píng)分為2分，著色為黃褐色評(píng)分為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為芯片置于顯微鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分率<10%評(píng)為0分；10%～<40%評(píng)為1分；40%～<70%評(píng)為2分，≥70%評(píng)為3分。將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分相加后得到的總分作為陰陽(yáng)性判斷的依據(jù)，0～2分評(píng)定為陰性；>2～6分評(píng)定為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，2組間及多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間中的2組比較采用Fisher檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法；采用Log-Rank檢驗(yàn)比較FOXF1陰性患者和陽(yáng)性患者之間總體生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤組織與癌旁組織中FOXF1、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)情況 139份腫瘤組織中FOXF1和E-cadherin的陽(yáng)性率低于癌旁組織(χ2=75.248，P=0.001；χ2=58.082，P=0.001)，腫瘤組織中N-cadherin的陽(yáng)性率高于癌旁組織(χ2=9.616，P=0.002)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 FOXF1、E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)情況[n(%)]

注：FOXF1主要定位于細(xì)胞核，A、B、C為癌旁組織，D、E、F為腫瘤組織，其中A、D、E為FOXF1陰性，B、C、F為FOXF1陽(yáng)性，箭頭所指為典型區(qū)域

圖1 FOXF1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)(SP，×200)

2.2乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)與腫瘤生物參數(shù)的關(guān)系 不同腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的乳腺癌組織中，F(xiàn)OXF1的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡，PR、ER、HER-2表達(dá)，組織學(xué)類型的乳腺癌組織中FOXF1的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)與乳腺癌臨床生物參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表2 乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)與乳腺癌臨床生物參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 FOXF1陽(yáng)性及陰性表達(dá)患者總體生存率分別為95.00%、72.73%，F(xiàn)OXF1陰性乳腺癌患者的總體生存率低于FOXF1陽(yáng)性乳腺癌患者的總體生存率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rank檢驗(yàn)，χ2=8.113，P=0.004)，見(jiàn)圖2。同樣，F(xiàn)OXF1陽(yáng)性、陰性表達(dá)患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為95.00%、63.64%，F(xiàn)OXF1陰性乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于FOXF1陽(yáng)性乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rank 檢驗(yàn)，χ2=4.396，P=0.036)。見(jiàn)圖3。

圖2 不同F(xiàn)OXF1表達(dá)的乳腺癌患者總體生存率生存曲線

圖3 不同F(xiàn)OXF1表達(dá)的乳腺癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率生存曲線

3 討 論

FOX基因家族編碼一組擁有叉頭結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，這類轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過(guò)程中有重要作用，同時(shí)也調(diào)控著細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝和免疫反應(yīng)等過(guò)程[2]。FOX家族的調(diào)控失調(diào)與許多腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[6,9-10]。其中FOXF1是FOX家族重要的成員，F(xiàn)OXF1陰性表達(dá)小鼠可出現(xiàn)肺部、膽囊、食管、氣管的間充質(zhì)發(fā)育的異常[11-13]。

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的疾病，隨著現(xiàn)代醫(yī)療手段的進(jìn)步，乳腺癌患者總體的預(yù)后較以往有很大的改善。但是仍有部分乳腺癌容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且缺乏有效的治療手段，這類患者的病死率很高，因此，揭示乳腺的發(fā)病機(jī)制，尋找防治的方法具有重要意義。FOXF1在乳腺癌中的研究很少，探討FOXF1在乳腺癌中的作用是一項(xiàng)有創(chuàng)新性的工作。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中FOXF1的表達(dá)明顯低于癌旁組織，這與其他研究者在前列腺癌、肺癌中的研究結(jié)果類似[5,10]。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，139份腫瘤組織中FOXF1和E-cadherin的陽(yáng)性率低于癌旁組織，腫瘤組織中N-cadherin的陽(yáng)性率高于癌旁組織，且不同腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的腫瘤組織FOXF1的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FOXF1可能與腫瘤增殖有關(guān)，與PK等[7]報(bào)道在乳腺癌中FOXF1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期類似；限于患者資料中TNM分期只有Ⅰ～Ⅲ期的資料，沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的資料，F(xiàn)OXF1表達(dá)越低，腫瘤越趨于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤組織中FOXF1表達(dá)越低，E-cadherin表達(dá)越低，N-cadherin表達(dá)越高。最近的研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，EMT的特征在于上皮標(biāo)志物如E-cadherin的減少和間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin、波形蛋白和纖連蛋白的誘導(dǎo)增加[14-15]，提示FOXF1可能具有通過(guò)EMT過(guò)程來(lái)抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用；TNM分期越高，腫瘤組織中FOXF1的陽(yáng)性表達(dá)率也高。以上結(jié)果均提示FOXF1參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

生存分析結(jié)果表明，F(xiàn)OXF1陰性患者總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯低于FOXF1陽(yáng)性患者，提示FOXF1表達(dá)越低，患者預(yù)后越差。這些研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXF1可作為判斷乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。乳腺癌的評(píng)估系統(tǒng)結(jié)合FOXF1的檢測(cè)可能會(huì)為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者的預(yù)后和個(gè)性化治療方案的制訂提供新的途徑。