李青青，張潤敏，石冠藍(lán)，姚攀鋒，王曉麗，李成磊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014）

黃酮類化合物是一類廣泛存在與植物中的多酚類次級代謝產(chǎn)物，主要包括黃酮、黃酮醇和花青素等幾大類。其中，黃酮醇化合物所占比例最大，約1/3左右，達(dá)2 000余種[1]。研究表明，黃酮醇不僅在植物中具有抵御紫外線傷害、抗寒抗旱、提高花粉萌發(fā)、促進(jìn)花粉管發(fā)育等作用[2-6]，在醫(yī)藥方面也具有多種功效如抗氧化抗衰老、抗炎、降糖降脂等[7-12]。

黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS，EC 1.14.11.23）是植物黃酮醇生物合成的關(guān)鍵酶，屬于α-ODD家族黃酮醇合酶，催化二氫黃酮醇C3位發(fā)生羥基化生成黃酮醇[4]。1985年L.Britsch等[13]首先從受輻射的歐芹體外細(xì)胞提取物中檢測到二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮醇；1993年T.A.Hoton等[14]首次從矮牽牛中分離得到FLS編碼基因，隨后在馬鈴薯、金魚草等物種中也分離得到FLS基因[15-16]；這些研究表明，F(xiàn)LS由多拷貝基因編碼且在不同植物中拷貝數(shù)不同，其表達(dá)量和底物偏愛性等與黃酮醇含量和分布等密切相關(guān)[17-20]。A.Fujita等[21]從葡萄中分離出5個VvFLS同源基因，VvFLS1-5在花中均有表達(dá)，VvFLS2、VvFLS4和VvFLS5在果皮也有表達(dá)，但只有VvFLS4能影響黃酮醇的合成。M.Mahajan等[22]研究發(fā)現(xiàn)在煙草中FLS基因轉(zhuǎn)錄后沉默不僅導(dǎo)致黃烷-3-醇含量升高、花青素含量降低，同時也導(dǎo)致煙草開花延遲、結(jié)實率嚴(yán)重下降。由此可見，F(xiàn)LS不僅直接影響黃酮醇的合成，對其他黃酮類化合物的積累以及植物某些生理特征也有很重要的影響[23]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）學(xué)名韃靼蕎麥，是一種藥食兩用小雜糧[24]。其生物活性成分主要為黃酮類化合物，其中屬于黃酮醇類的蘆丁含量最高，約占總黃酮的80%[25]。由于苦蕎食品和保健品日益受到廣大消費者的青睞，使得苦蕎黃酮代謝研究也成為植物次生代謝的熱點之一。目前，苦蕎黃酮醇合酶的同源基因FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3已被克隆，且對其抗非生物脅迫及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，表明這些基因的表達(dá)特征和酶學(xué)特征都有所不同[26-27]。隨著苦蕎轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)的日益豐富，可能會有更多的黃酮醇合酶同源基因被發(fā)現(xiàn)。本研究基于苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組，篩選獲得一條注釋為黃酮醇合酶的新基因序列FtFLS4，通過RT-PCR技術(shù)克隆該基因，并采用生物信息學(xué)分析其編碼蛋白的分子特征，構(gòu)建其重組原核表達(dá)載體實現(xiàn)在大腸桿菌中的表達(dá)，進(jìn)而采用薄層層析技術(shù)對其表達(dá)產(chǎn)物的催化活性進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

苦蕎（“西蕎二號”）種植于四川省雅安市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和原核表達(dá)載體pET-30b(+)由本實驗室保存，其他藥品為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆

通過對苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的篩選，成功獲得5條含有完整ORF框的FtFLS基因，其cDNA序列長度均為1 000 bp左右。其中FtFLS1-3基因已被成功克隆[27]，剩余2條FtFLS基因其中一條基因表達(dá)量在各組織中明顯高于另一條，為鑒定其功能并進(jìn)一步研究苦蕎黃酮醇合酶，對該基因進(jìn)行克隆并命名為FtFLS4。

采用改良SDS法[28]提取苦蕎花期總DNA。采用RNAout試劑盒（天澤基因工程有限公司）提取苦蕎花期總RNA，以其為模板通過Revert AidTM First Strand Cdna Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）制備cDNA第一鏈。根據(jù)苦蕎轉(zhuǎn)錄組設(shè)計引物（見表1）。以花期苦蕎cDNA及總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA模板1 μL，上下游引物各 1.5 μL，高保真 DNA 聚合酶（Prime STAR HS Polymerase，TaKaRa）12.5 μL 及無菌去離子水8.5 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。按照DNAA-Tailing Kit試劑盒說明書對回收產(chǎn)物進(jìn)行加A后克隆到pMD 19-T Simple Vector，篩選陽性轉(zhuǎn)化子測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

利用DNAman 8.0拼接測序結(jié)果，分析苦蕎FtFLS4基因內(nèi)含子和外顯子，并推導(dǎo)其氨基酸序列。利用Clustal X對FtFLS4基因編碼蛋白進(jìn)行多重序列比對，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載其他植物黃酮醇合酶序列，采用MEGA5.0軟件根據(jù)鄰接法，重復(fù)1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。采用SOMPA預(yù)測氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)，并使用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對其進(jìn)行分子量及等電點預(yù)測。利用蛋白質(zhì)建模軟件SWISS-Model建立蛋白質(zhì)模型，并使用Discovery Studio 2.5對接程序?qū)tFLS4蛋白模型與3種底物進(jìn)行分子對接，底物的三維結(jié)構(gòu)由chEBI（http：//www.ebi.ac.uk/chebi/init.do）數(shù)據(jù)庫下載[二氫槲皮素（ChEBI：17948）、二氫山奈酚（ChEBI：15404）和二氫楊梅素（ChEBI：28429）]。

表1 基因克隆及表達(dá)載體引物序列Table 1 Primers used for gene cloning and expression vector

1.2.3FtFLS4基因的原核表達(dá)及蛋白純化

以含F(xiàn)tFLS4基因的T載體質(zhì)粒為模板，用引入酶切位點的引物（見表1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核表達(dá)載體pET-30b(+)。將pET-30b(+)-FtFLS4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落接種到10 mL液體LB培養(yǎng)基中（含卡那霉素）37℃過夜培養(yǎng)。按2%接種量接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基（含卡那霉素），37℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L，22℃誘導(dǎo)6 h。收集菌體后按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒His-Tagged Protein Purification Kit（康為世紀(jì)生物科技有限公司）的操作步驟進(jìn)行蛋白分離純化。

1.2.4 重組FtFLS4的催化活性鑒定

采用薄層層析技術(shù)（TLC）對酶的活性進(jìn)行定性分析。參照Li C.[7]的方法，反應(yīng)體系（總體積500 μL）中包括100 μmol/L底物（二氫槲皮素、二氫山奈酚、二氫楊梅素），111 mmol/L 乙酸鈉，83 μmol/Lα-酮戊二酸，42 μmol/L 硫酸鐵，2.5 mmol/L 維生素 C（pH 5.0），約 12.5 μg純化蛋白，37℃反應(yīng) 20 min后用等體積乙酸乙酯萃取，進(jìn)行薄層層析定性分析。依照中國藥典進(jìn)行TLC檢測[29]，以二氫黃酮醇、黃酮醇及兩者混合物為對照，將反應(yīng)萃取物點樣于羧甲基纖維素鈉硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶2∶2為展層劑進(jìn)行展層，碘蒸氣顯色并計算各斑點的Rf值。

采用分光光度法對酶的活性進(jìn)行定量分析。將不同質(zhì)量濃度（0.5、1、2、3、5、7、9、12 和 15 μg/mL）的槲皮素、山奈酚和楊梅素溶于反應(yīng)緩沖液中，利用紫外可見分光光度計（Shimadz，Japan）測得其吸光度并以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將酶促反應(yīng)液于對應(yīng)波長測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算產(chǎn)物生成量進(jìn)而計算比活力。酶活力單位采用國際酶單位（IU），即每分鐘生成1 μmol產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 FtFLS4基因的克隆及序列分析

以苦蕎花期總cDNA及DNA為模板，用引物FtFLS4f和FtFLS4r進(jìn)行PCR擴(kuò)增后分別獲得1條約1 000 bp的特異條帶。測序結(jié)果顯示，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1 026 bp和1 126 bp。序列分析表明，苦蕎FtFLS4cDNA序列包含1個1 026 bp的ORF，編碼341個氨基酸殘基；DNA序列為1 126 bp，外顯子與cDNA序列一致，包含1個100 bp的內(nèi)含子，其序列符合GT-AG剪接規(guī)則（見圖1）。

圖1 苦蕎FtFLS4的基因結(jié)構(gòu)Figure 1 Gene structures of FtFLS4 of tartary buckwheat

Protparam在線軟件預(yù)測推導(dǎo)的FtFLS4蛋白理論分子量大小為39.2 kDa，等電點（pI）為5.79。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)tFLS4主要由α-螺旋（36.95%）、β-轉(zhuǎn)角（6.74%）、β-片層（22.58%）以及無規(guī)則卷曲（33.72%）組成。將苦蕎FtFLS4的氨基酸序列與苦蕎其他4條FtFLS序列（FtFLS1：GenBank ID AEC33116.1，F(xiàn)tFLS2：GenBank ID AGE13752.1）及甜蕎（GenBank ID：AEC33115.1）、金蕎（GenBank ID：AHN19765.1）、擬南芥（GenBank ID：CAP09052.1）、葡萄（GenBank ID：BAE75810.1）和草莓（GenBank ID：ABH07784.1）的FLS序列進(jìn)行多重序列比對，見圖2。結(jié)果顯示，F(xiàn)tFLS4具有α-ODD家族保守功能區(qū)域[30]（conserved domain A和conserved domain B）及Fe2+和α-酮戊二酸結(jié)合位點。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示，該進(jìn)化樹主要聚為3簇：第I簇由苦蕎FtFLS1、FtFLS3及甜蕎、金蕎、荷蘭芹等雙子葉植物FLS聚成，Li C.等[7]研究表明FtFLS1在三級結(jié)構(gòu)N-末端含有第1個α-螺旋，具有酶催活性；第Ⅱ簇由擬南芥AtFLS1-6及紫羅蘭和裸莖條果芥FLS聚成，均屬十字花科植物，其中AtFLS1-6中僅有AtFLS1和AtFLS3具有酶催活性，其他4個因三級結(jié)構(gòu)N-末端缺失第1個α-螺旋而喪失活性[17]；第Ⅲ簇由苦蕎FtFLS2、FtFLS4及裸子植物銀杏、單子葉植物玉米和大麥、雙子葉植物茶樹和葡萄的FLS聚成，研究表明玉米ZmFLS在三級結(jié)構(gòu)N-末端也含有第1個α-螺旋且具有酶催活性[19]。本研究中苦蕎FtFLS4與玉米親緣關(guān)系最近，表明其可能具有相似的功能；此外與苦蕎其他FLS雖來源于同一物種，但卻處于不同的兩大簇，進(jìn)化上出現(xiàn)了分化，推測其酶催活性等功能可能存在差異。

圖2 苦蕎FtFLS4編碼蛋白的多重序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of tartary buckwheat FtFLS4 with FLSs in others plants

圖3 不同植物FLS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequence encoded by FLS gene in different plant species

2.2 FtFLS4編碼蛋白模型及分子對接

利用蛋白質(zhì)建模軟件SWISS-MODEL，以擬南芥無色花青素雙加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）結(jié)晶結(jié)構(gòu)為模板建立FtFLS4的蛋白模型，并將蛋白模型與3種二氫黃酮醇進(jìn)行分子對接（見圖4）。FtFLS4為球狀蛋白，其底物結(jié)合位點位于蛋白質(zhì)表面且主要由短序列的α-螺旋和無規(guī)則卷曲形成活性中心口袋，其中His215、Asp217和His272為Fe2+離子結(jié)合位點，Arg282和Ser284為α-酮戊二酸結(jié)合位點。在FtFLS4-DHQ模型中，Gln219和Gln196與二氫槲皮素分子形成氫鍵；FtFLS4-DHK模型中，Asp217、Gln219和Gln196與二氫山奈酚分子形成氫鍵；FtFLS4-DHM 模型中，Thr216、Arg194、Gln219和 Gln196與二氫楊梅素分子形成氫鍵。Gln219、Tyr218、His215、Arg194和 Phe288等氨基酸殘基提供疏水性環(huán)境和電子拉鏈以穩(wěn)定酶促反應(yīng)微環(huán)境。分子對接結(jié)果顯示FtFLS4通過活性中心的氨基酸殘基可與3種二氫黃酮醇形成酶-底物復(fù)合物，推測該蛋白可能具有酶催活性。

圖4 苦蕎FtFLS4的同源建模及分子對接Figure 4 The homology modeling and molecular docking of FtFLS4

2.3 FtFLS4基因在大腸桿菌中的表達(dá)

含有pET-30b(+)-FtFLS4重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對表達(dá)蛋白產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，見圖5。結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的基因工程菌可見一條約40 kDa的新生帶，與理論相對分子質(zhì)量一致。重組蛋白主要以可溶狀態(tài)表達(dá)，且表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間逐漸增加。表達(dá)蛋白經(jīng)His-tag親和層析純化后獲得了條帶單一的融合表達(dá)酶蛋白，可用于后續(xù)酶催活性鑒定。

2.4 FtFLS4表達(dá)蛋白的酶催活性鑒定

采用薄層層析法對FtFLS4表達(dá)蛋白酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定（見圖6）。FtFLS4的酶促反應(yīng)液樣品均在接近黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品（槲皮素、楊梅素和山奈酚）的位置新出現(xiàn)一個斑點。二氫槲皮素和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品Rf值分別為0.16和0.27；二氫楊梅素和楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品Rf值分別為0.11和0.18；二氫山奈酚和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品Rf值分別為0.28和0.37。而FtFLS4的3種酶促反應(yīng)液中兩種物質(zhì)的Rf值均與標(biāo)準(zhǔn)品接近。結(jié)果表明，F(xiàn)tFLS4具有催化3種二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化為黃酮醇的催化活性。此外，酶學(xué)活性測定表明，重組FtFLS4蛋白以二氫槲皮素、二氫山奈酚和二氫楊梅素為底物，其比活力分別為25.19×10-3、48×10-3和 19.04×10-3IU/mg。

圖5 FtFLS4在大腸桿菌中的表達(dá)分析Figure 5 SDS-PAGE analysis of FtFLS4 expressed in E.coli

圖6 苦蕎黃酮醇合酶FtFLS4酶催活性的薄層層析鑒定Figure 6 Activity identification for tartary buckwheat FtFLS4 with thin layer chromatography

3 討論與結(jié)論

黃酮醇合酶是黃酮類化合物代謝途徑的關(guān)鍵酶，其催化二氫黃酮醇生成黃酮醇，對植物黃酮醇和花青素的合成及積累都有重要影響[14]。FLS屬于α-同戊二酸依賴性雙加氧酶（α-oxoglutaratedependent dioxygenase，α-ODD）家族的成員，該家族還包括黃酮類化合物合成途徑的黃烷酮-3-羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃酮合酶（flavone synthase，F(xiàn)NS）和花青素合酶（anthocyanidin synthase，ANS）[31]。研究表明，α-ODD 基因都含有 2 個高度保守的功能區(qū)域，及α-酮戊二酸和Fe2+結(jié)合位點（Arg-X-Ser，His-Asp-His），推測可能與酶生物活性相關(guān)[32]。本研究所得FtFLS4含有α-ODD中2個高度保守的結(jié)構(gòu)域和相關(guān)活性位點（His215、Asp217和His272為 Fe2+離子結(jié)合位點，Arg282和 Ser284為α-酮戊二酸結(jié)合位點）。因此，從分子結(jié)構(gòu)上推測，F(xiàn)tFLS4可能具有黃酮醇合酶應(yīng)具有的催化功能。同時，F(xiàn)tFLS4與3種二氫黃酮醇的分子對接分析結(jié)果也進(jìn)一步支持上述推測。

植物FLS屬于多拷貝基因，例如擬南芥有6個拷貝，玉米有 3 個拷貝，柑橘有 5 個拷貝[17，19，32]。已有研究表明，苦蕎FtFLS基因也存在多拷貝[33]，并已分離克隆了3個FtFLS同源基因[27]。不同拷貝之間編碼的氨基酸序列上雖有著較高相似性，但三維結(jié)構(gòu)卻存在差異，這些差異最終導(dǎo)致彼此之間有著不同的酶學(xué)活性及催化特征。擬南芥FLS基因的6個拷貝中，僅有AtFLS1和AtFLS3編碼蛋白具有催化活性，其他4個拷貝由于三級結(jié)構(gòu)N-末端第一個α-螺旋缺失導(dǎo)致其活性喪失。其中，AtFLS1能有效催化擬南芥中黃酮醇的合成，而AtFLS3有著寬松的底物選擇性[17]。柑橘CuFLS[31]都趨向于催化二氫山奈酚，而玉米ZmFLS1[19]卻更加偏愛二氫槲皮素。本研究表明，苦蕎FtFLS1與FtFLS3與同屬蓼科植物的金蕎和甜蕎，親緣性最近，F(xiàn)tFLS2與雙子葉植物葡萄和茶樹親緣關(guān)系最近，而FtFLS4與單子葉植物玉米和大麥親緣性最近，說明苦蕎FtFLS同源基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)分化，其編碼蛋白的催化活性和底物特異性可能存在差異。盡管通過大腸桿菌表達(dá)的苦蕎FtFLS1-4對3種二氫黃酮醇均表現(xiàn)出催化活性，但FtFLS1和FtFLS2對二氫槲皮素具有底物偏愛性，而FtFLS3和FtFLS4則更偏愛二氫山奈酚[27]?？梢姡嗍w中的黃酮醇合酶基因及其編碼蛋白在進(jìn)化和功能上具有多樣性。

目前，苦蕎基因組測序已經(jīng)完成[34]，這使得在基因組尺度上的黃酮合酶基因進(jìn)化分析和功能鑒定成為可能，可望進(jìn)一步加深對苦蕎黃酮醇合成、調(diào)控及其對發(fā)育和抗逆生理的理解。