王航 宋歌 劉永建 謝萬(wàn)福

星形細(xì)胞瘤是人類最常見的腦腫瘤。世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]根據(jù)腫瘤的程度將星形細(xì)胞瘤分為4級(jí)，其中Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)腫瘤是高度惡性的，分別以間變性星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)為例，它是人類最常見和最惡性的原發(fā)性腦腫瘤。為了早預(yù)防早治療，進(jìn)行了大量與星形細(xì)胞瘤的嚴(yán)重程度相關(guān)的生物標(biāo)志物如環(huán)氧合酶-2[2]，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白[3]、肌醇[4]的表達(dá)水平影響星形細(xì)胞瘤進(jìn)展的研究。然而相關(guān)的機(jī)制研究較少。

癌癥干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)是指具有干細(xì)胞特征的癌細(xì)胞，能夠自我更新，并且產(chǎn)生異質(zhì)性的腫瘤[5]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中CSC細(xì)胞的放射性抗性和化療耐藥性已被確定[6-7]，這是患者臨床療效差的一個(gè)原因。CSCs對(duì)抗化療可能是因?yàn)镃D133+細(xì)胞下調(diào)自噬相關(guān)蛋白[8]。

自噬構(gòu)成了分解代謝機(jī)制，通過(guò)溶酶體降解不必要或功能失調(diào)的細(xì)胞組分[9]。最近的研究表明，自噬不僅在調(diào)控癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且在癌細(xì)胞對(duì)抗癌治療的反應(yīng)方面也可能發(fā)揮作用[10-11]。隨后的研究還鑒定了微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)[12-13]和Beclin-1[14-15]作為自噬的基本標(biāo)記。其中LC3B是化療后晚期乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)[16]。

本研究評(píng)估星形細(xì)胞瘤患者中LC3B和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，由于癌樣干細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)是新型抗癌療法的有吸引力的靶標(biāo)[17-18]，本研究也分析了CD133在星形細(xì)胞瘤患者中的表達(dá)水平。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)手術(shù)記錄、醫(yī)療記錄、病理報(bào)告和MRI圖像，回顧性收集本院神經(jīng)外科于2009年12月-2012年12月診斷的星形細(xì)胞瘤患者的218張薄切片。排除了免疫組織化學(xué)染色較差的樣本、病例記錄不完整或沒有隨訪資料的患者。最后本研究共選取106個(gè)樣本進(jìn)行研究。本研究經(jīng)本院評(píng)估委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

為了檢索免疫組織化學(xué)染色的抗原，福爾馬林固定，石蠟包埋的組織塊的3 μm切片脫石蠟，再水合，并在121 ℃的溫度下在pH9.0的目標(biāo)回收溶液(Dako，Glostrup，丹麥)中高壓滅菌10 min；通過(guò)在室溫下在3%過(guò)氧化氫中孵育5 min來(lái)阻斷切片中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；然后將切片在Tris緩沖液(Dako，K9001)中洗滌并與1∶200稀釋的兔多克隆抗人CD133(Biorbyt，orb18124，UK)，Beclin-1(abcam，ab16998，USA)和LC3B (SANTACRUZE，sc-16755，歐洲)抗體在室溫下1 h；用Tris-緩沖溶液洗滌后將切片與綴合有辣根過(guò)氧化物酶的第二抗體在室溫下孵育30 min；隨后將載玻片在3,3-二氨基聯(lián)苯胺中孵育5 min，然后將梅耶蘇木精復(fù)染60 s，并用Entellan(產(chǎn)品編號(hào)HX247305，Merck)固定；在雙盲的情況下評(píng)估免疫組織化學(xué)染色的切片；Beclin-1和LC3B的染色評(píng)分如下：陰性：0分(沒有或<10%的腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞)；弱陽(yáng)性：1分(腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞10%～30%)；陽(yáng)性：2分(30%～70%的腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞)；強(qiáng)陽(yáng)性：3分(70%～100%)。CD133染色評(píng)分為陰性：0分(如果65%的細(xì)胞被抗體染色)；弱陽(yáng)性：1分(5%～20%，包括20%的染色細(xì)胞)；陽(yáng)性：2分(20%～50%，包括50%的染色細(xì)胞)；強(qiáng)陽(yáng)性：3分(>50%的染色細(xì)胞)[19]。對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析，0分和1分定義為低表達(dá)組，2分和3分定義為高表達(dá)組[20]。同時(shí)從病例中獲取患者的年齡、性別、腫瘤分級(jí)、接受放療或化療的基本資料。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 (SPSS，Chicago，IL，USA)；采用卡方檢驗(yàn)分析Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)分析生存率。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LC3B和Beclin-1蛋白表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系

圖1和圖2分別顯示了Beclin-1和LC3B的表達(dá)水平強(qiáng)弱，即低、中、高強(qiáng)度的免疫化學(xué)染色。星形細(xì)胞瘤患者的年齡、性別、腫瘤分級(jí)以及化療耐受性均未與Beclin-1蛋白表達(dá)水平有關(guān)系(表1)。LC3B蛋白表達(dá)水平與輻射或化療有關(guān)系(P=0.02)。沒有其他臨床參數(shù)與LC3B蛋白表達(dá)水平有關(guān)系(表1)。Beclin-1蛋白表達(dá)水平與患者其他的臨床參數(shù)無(wú)明顯關(guān)系，同時(shí)與患者輻射、化療也無(wú)明顯關(guān)系(表1)。

圖1 星形細(xì)胞瘤切片中Beclin-1蛋白表達(dá)水平的代表性免疫組織化學(xué)染色 A為0分,極低強(qiáng)度組;B為得分1,低強(qiáng)度組;C為得分2,中強(qiáng)度組;D為3分,高強(qiáng)度組(×100倍)

2.2 LC3B和Beclin-1蛋白表達(dá)水平與生存率的關(guān)系

Beclin-1蛋白表達(dá)水平與患者的總體生存率不相關(guān)(圖3)。相反，LC3B的免疫化學(xué)染色的高強(qiáng)度預(yù)測(cè)不良預(yù)后(圖4)。同樣，LC3B蛋白表達(dá)陰性或弱陽(yáng)性表現(xiàn)出與高LC3B水平相似的生存曲線。LC3B表達(dá)的低水平和中等水平的生存率要比LC3B表達(dá)的高水平的生存率高(圖4)。

圖2 星形細(xì)胞瘤切片中LC3B蛋白表達(dá)水平的代表性免疫組織化學(xué)染色 A為0分,極低強(qiáng)度組;B為得分1,低強(qiáng)度組;C為得分2,中強(qiáng)度組;D為3分,高強(qiáng)度組(×100倍)

表1 Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系

注：LC3B為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B型

圖3 使用Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗(yàn)評(píng)估Beclin-1蛋白表達(dá)水平與星形細(xì)胞瘤患者總生存率的關(guān)系(P>0.05)

圖4 使用Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗(yàn)評(píng)估LC3B蛋白表達(dá)水平與星形細(xì)胞瘤患者總生存率的關(guān)系 高強(qiáng)度的LC3B免疫組織化學(xué)染色預(yù)測(cè)不良預(yù)后;LC3B蛋白表達(dá)陰性也存在相似的生存曲線

2.3 CD133和LC3B表達(dá)水平在星形細(xì)胞瘤中的預(yù)后價(jià)值

圖5顯示了具有弱、低、中、高強(qiáng)度的CD133的代表性免疫化學(xué)染色切片。CD133和LC3B高表達(dá)的患者的總生存期為38個(gè)月，而CD133和LC3B兩者均為弱表達(dá)的患者的總生存期為170個(gè)月(圖6)。CD133和LC3B的高水平表達(dá)是星形細(xì)胞瘤預(yù)后不良的指標(biāo)(P<0.05)。

圖5 在星形細(xì)胞瘤切片中代表性的免疫組織化學(xué)染色CD133(癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)記物) A為0分,極低強(qiáng)度組;B為得分1,低強(qiáng)度組;C為得分2,中強(qiáng)度組;D為3分,高強(qiáng)度組(×100倍)

3 討 論

Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤是最常見的一類惡性原發(fā)性腦腫瘤，也是最具侵襲性的癌癥之一。先前的研究表明，癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)放療或化療耐藥[6]，并且這些細(xì)胞的富集是預(yù)后不良的指征[21-23]。由于LC3B蛋白的表達(dá)水平與放療和化療的耐藥性相關(guān)(表1)，本研究評(píng)估了CD133與LC3B在總體生存中的表達(dá)。診斷后的中位生存期通常只有14個(gè)月[24]。GBM管理的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)切除、局灶放療、以及替莫唑胺等烷化劑治療[25]。然而這些治療方法并不能有效地提高GBM患者的存活率。因此，目前研究主要集中在探究預(yù)測(cè)患者預(yù)后的通路和分子標(biāo)記方面上。

圖6 使用Kaplan-Meiermethod和log-rank檢驗(yàn)評(píng)估CD133和LC3B蛋白表達(dá)水平的組合與星形細(xì)胞瘤患者的生存率的關(guān)系 CD133和LC3B高表達(dá)患者的平均總生存期為38個(gè)月,CD133和LC3B兩者均為弱表達(dá)的患者的平均總生存期為50個(gè)月

本研究發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的表達(dá)水平增高與星形細(xì)胞瘤患者的放療/化療有關(guān)，并且影響患者的生存率。此外，增加LC3B的表達(dá)以及增強(qiáng)的CD133水平也與不良預(yù)后顯著相關(guān)。有研究報(bào)道，自噬抑制劑可使肝癌干細(xì)胞(LCSCs)、乳腺癌細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境更敏感，并可用于改善抗癌治療[24]。同樣，雷帕霉素在神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬也增加了對(duì)輻射的敏感性[26]。

自噬構(gòu)成了基本的分解代謝機(jī)制，其涉及通過(guò)溶酶體降解不必要或功能失調(diào)的細(xì)胞組分[9]。自噬是一把雙刃劍，一方面自噬可以上調(diào)自噬水平導(dǎo)致耐藥性的癌細(xì)胞的凋亡；另一方面惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散也離不開自噬的作用，腫瘤細(xì)胞在抵抗化療藥物殺傷過(guò)程中自噬也起到重要保護(hù)作用。通過(guò)激活自噬，選擇性識(shí)別和清除未折疊蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器，從而避免凋亡作用發(fā)生[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高水平的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B導(dǎo)致與放射和/或化學(xué)療法的抗性顯著相關(guān)。在我們的研究中增強(qiáng)的自噬是疾病進(jìn)展的結(jié)果，而不是由其他研究者報(bào)道的化學(xué)誘導(dǎo)[26]。此外，本研究使用的細(xì)胞類型與其他研究中使用的細(xì)胞類型明顯不同，因?yàn)镚BM對(duì)化療和放療高度耐藥。需要進(jìn)一步的探究自噬標(biāo)記物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。本研究Beclin-1沒有表現(xiàn)出類LC3B的特性，對(duì)于Beclin-1的分析還需進(jìn)一步研究。

有研究指出，由于自噬能力下調(diào)，GBM中LC3B-II和Beclin-1的表達(dá)水平降低[19]。與本研究結(jié)果一致，本研究還發(fā)現(xiàn)LC3B的高水平表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果表明，雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，自噬減少會(huì)導(dǎo)致更晚期的星形細(xì)胞瘤。自噬在腫瘤發(fā)生中的作用是復(fù)雜的[27]。它一方面可以抑制腫瘤發(fā)生早期的腫瘤發(fā)展；另一方面自噬還可以促進(jìn)已建立腫瘤的腫瘤進(jìn)一步發(fā)展。本研究結(jié)果表明，高水平的LC3B表達(dá)或增強(qiáng)自噬與預(yù)后不良和自噬作為腫瘤啟動(dòng)子的作用相一致。

最近，GBM癌癥干細(xì)胞已經(jīng)被證明參與了腫瘤內(nèi)皮的形成，增加了腫瘤的侵襲力，并且通過(guò)各種機(jī)制導(dǎo)致對(duì)放療的抵抗。本研究結(jié)果表明CD133(癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物)和LC3B的高水平表達(dá)是星形細(xì)胞瘤預(yù)后不良的指征。這些結(jié)果表明，星形細(xì)胞瘤癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞和增強(qiáng)的自噬可引起對(duì)放射療法/化學(xué)療法的抗性，并且針對(duì)星形細(xì)胞瘤中的癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞可提供可行的治療方法。