黃東航 陳旭 陳興

[摘要]目的 探討細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine檢測(cè)在甲狀腺微小乳頭狀癌中的臨床意義。方法 選取2014年8月～2017年5月我院收治的50例甲狀腺微小乳頭狀癌患者、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的術(shù)中細(xì)針穿刺標(biāo)本作為研究對(duì)象，觀察兩類病理類型免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Midkine的表達(dá)。結(jié)果 甲狀腺微小乳頭狀癌細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine的表達(dá)明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine表達(dá)陽(yáng)性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 檢測(cè)細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine的表達(dá)可為甲狀腺微小乳頭狀癌的正確診斷和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)提供幫助。

[關(guān)鍵詞]中期生長(zhǎng)因子；甲狀腺癌；腫瘤標(biāo)志物；免疫細(xì)胞化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R736.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）7（c）-0117-03

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of fine-needle aspiration specimen Midkine detection in papillary thyroid microcarcinoma. Methods Fine-needle aspiration specimens from 50 patients with papillary thyroid microcarcinoma and 30 patients with thyroid nodular goiter who were admitted to our hospital and underwent surgery from August 2014 to May 2017 were selected as objects. Immunocytochemical expression of Midkine was observed in fine-needle aspiration specimens from above patients. Results Fine-needle aspiration specimen Midkine expression of papillary thyroid microcarcinoma was significantly higher than that of thyroid nodular goiter， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The positive rate of Midkine expression in patients with lymph node metastasis of papillary thyroid microcarcinoma was higher than that of patients without lymph node metastasis， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The detection of fine-needle aspiration specimen Midkine is helpful in the diagnosis of papillary thyroid microcarcinoma and the prediction of lymph node metastasis.

[Key words] Midkine； Thyroid carcinoma； Tumor marker； Immunocytochemistry

甲狀腺乳頭狀癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來不斷升高，其中大部分是微小乳頭狀癌[1-3]。甲狀腺微小乳頭狀癌是指腫瘤長(zhǎng)徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀癌，預(yù)后通常較好，但是也有部分病例具有高侵襲性[4-6]。因其體積較小，常伴發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，極易被漏診或誤診。細(xì)針穿刺活檢是目前術(shù)前診斷甲狀腺乳頭狀癌最有效準(zhǔn)確的方法[7-9]，但由于細(xì)針穿刺所獲標(biāo)本量有限，不能反映病變?nèi)?，約20%的結(jié)節(jié)仍難以準(zhǔn)確定性[10-11]。因此，尋找能夠幫助診斷甲狀腺微小乳頭狀癌的分子標(biāo)志物十分必要。有研究表明，甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本的Midkine（中期生長(zhǎng)因子）表達(dá)水平明顯高于甲狀腺良性病變[12-13]。本研究在甲狀腺微小乳頭狀癌的細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行Midkine檢測(cè)，探討其對(duì)甲狀腺微小乳頭狀癌鑒別診斷的應(yīng)用價(jià)值及與臨床病理因素的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年8月～2017年5月我院收治的50例甲狀腺微小乳頭狀癌患者、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的術(shù)中細(xì)針穿刺標(biāo)本作為研究對(duì)象?；颊咝g(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。甲狀腺微小乳頭狀癌組患者中，男14例，女36例；年齡22～67歲，平均（48±7）歲。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組患者中，男9例，女21例；年齡25～59歲，平均（46±8）歲。甲狀腺微小乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均知曉本研究情況并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 用22 G針頭接10 ml一次性注射器，在甲狀腺結(jié)節(jié)中多點(diǎn)、反復(fù)負(fù)壓抽吸3～5次，將抽出物直接均勻涂于3～8張多聚賴氨酸處理過的玻片上。玻片置于95%酒精中固定15 min，然后放入保濕密閉的切片盒中，置于-20℃冰箱中冷凍保存待用。

1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)試劑 兔抗人Midkine抗體購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司；兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV9001）及二氨基聯(lián)苯胺顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 于冰箱中取出細(xì)胞涂片，置室溫10～15 min復(fù)溫。經(jīng)蒸餾水洗滌后，在檸檬酸鹽緩沖液pH6.0中抗原熱修復(fù)20 min。3%過氧化氫室溫孵育10～20 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加牛血清白蛋白封閉，室溫孵育20 min。滴加100倍稀釋的一抗兔抗人Midkine抗體4℃過夜，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。置于37℃水浴鍋內(nèi)復(fù)溫45 min。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，37℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，37℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min，雙蒸水沖洗。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

以細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有清晰棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞占比≥10%的標(biāo)本判定為陽(yáng)性，反之，判定為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1甲狀腺微小乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine表達(dá)陽(yáng)性率的比較

甲狀腺微小乳頭狀癌細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.2不同臨床病理特征甲狀腺微小乳頭狀癌患者細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine表達(dá)陽(yáng)性率的比較

不同性別、年齡、被膜有/無侵犯甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺微小乳頭狀癌患者21例，Midkine陽(yáng)性表達(dá)14例（66.7%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺微小乳頭狀癌患者29例，Midkine陽(yáng)性表達(dá)27例（93.1%），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine表達(dá)陽(yáng)性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

目前術(shù)前診斷甲狀腺微小乳頭狀癌最有效準(zhǔn)確的方法是細(xì)針穿刺活檢。由于細(xì)針穿刺活檢獲得的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中組織形態(tài)與細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)大部分喪失，病理醫(yī)師進(jìn)行診斷時(shí)主要依賴于對(duì)細(xì)胞，主要是其細(xì)胞核形態(tài)特征性改變的識(shí)別，如核膜不規(guī)則、核溝、核內(nèi)假包涵體、毛玻璃樣核及砂礫體形成等，但不少甲狀腺微小乳頭狀癌并不具備這些典型特征。許多良性腫瘤病變及非腫瘤病變也可有核溝、毛玻璃樣核等改變。特別是甲狀腺微小乳頭狀癌結(jié)節(jié)小，穿刺獲得的標(biāo)本細(xì)胞含量往往少，常常僅含有少量的腫瘤細(xì)胞，診斷和鑒別診斷更成困難[14]。為提高甲狀腺癌術(shù)前診斷的準(zhǔn)確性，目前進(jìn)行了大量關(guān)于甲狀腺癌分子標(biāo)志物的研究[15]。

Midkine又稱中期生長(zhǎng)因子，最初在視磺酸誘導(dǎo)分化的早期胚胎瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。Midkine在妊娠中期胚胎組織大量表達(dá)，分布廣泛，之后逐漸減少，成年后只在少數(shù)組織中可檢測(cè)出。Midkine具有多種生物學(xué)活性，可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、有絲分裂及細(xì)胞分化，增強(qiáng)纖維溶酶活性，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)等[16]。近年已有研究發(fā)現(xiàn)，Midkine在多種腫瘤組織中過度表達(dá)，不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有對(duì)抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，影響腫瘤細(xì)胞的存活、增殖與分化，還可參與腫瘤的血管生成，直接參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過程[17]。Maeda等[18]發(fā)現(xiàn)，Midkine在胰頭癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為53.3%，Midkine表達(dá)陽(yáng)性的患者5年生存率低于表達(dá)陰性的患者，多變量分析表明Midkine表達(dá)是胰頭癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Zhao等[19]報(bào)道，Midkine在胃癌組織中呈過表達(dá)，而且其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Midkine表達(dá)陰性的胃癌患者5年生存率高于表達(dá)陽(yáng)性的患者。Jham等[20]研究表明，Midkine在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)增加，并和腫瘤分期密切相關(guān)，在晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)更高。

本研究通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)甲狀腺微小乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者細(xì)針穿刺標(biāo)本中Midkine的表達(dá)，結(jié)果提示，甲狀腺微小乳頭狀癌細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine的檢測(cè)可為甲狀腺微小乳頭狀癌的正確診斷提供參考。接著按照多種臨床病理參數(shù)進(jìn)行分層分析，研究結(jié)果提示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine表達(dá)陽(yáng)性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示甲狀腺微小乳頭狀癌細(xì)針穿刺標(biāo)本中Midkine的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，細(xì)針穿刺標(biāo)本Midkine的檢測(cè)可為甲狀腺微小乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)進(jìn)而為治療決策的制定提供幫助。但本研究樣本較少，有必要進(jìn)行更大樣本的研究。

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（收稿日期：2018-03-15 本文編輯：孟慶卿）