周 勇，史玉恒，范玉頂，劉文枝，江 南，趙建青，許 晨，曾令兵

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

鯽(Carassiusauratus)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年全國(guó)鯽養(yǎng)殖產(chǎn)量為300.52萬(wàn)t，約占全國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量的10.67%[1]。由于鯽養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，集約化程度的提高以及養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化，鯽的病害問(wèn)題日益突出，給鯽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)感染養(yǎng)殖鯽引起的造血器官壞死癥是我國(guó)新出現(xiàn)的一種病毒性疾病，其傳染性強(qiáng)，死亡率高，危害嚴(yán)重[2，3]。

CyHV-2，又稱(chēng)為皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒(HVHNV)(Jung et al，1995)或金魚(yú)(C.auratusauratus)造血器官壞死癥病毒(GFHNV)(Groff et al，1998)，屬異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)成員(Davison et al，2009)。1992年，首次從日本患病金魚(yú)組織內(nèi)分離到CyHV-2，其致死率達(dá)100%[4]。隨后陸續(xù)在亞洲、美洲、澳洲、歐洲的患病金魚(yú)組織中檢測(cè)到該病毒[5]。2011年首次在匈牙利養(yǎng)殖鯽組織內(nèi)分離出CyHV-2，隨后多國(guó)暴發(fā)了由該病毒引起鯽大量死亡的事件[6-8]。自2012年起，CyHV-2已在我國(guó)多個(gè)省市報(bào)道檢出，其傳播呈快速擴(kuò)散的趨勢(shì)[9]。

目前，針對(duì)CyHV-2感染尚無(wú)有效的防治藥物。因此，研制有效的診斷試劑和疫苗，無(wú)疑有助于鯽造血器官壞死癥的診斷和防控。本研究利用生物軟件分析CyHV-2 ORF25編碼蛋白的抗原表位，選取富含抗原表位的區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)截短蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫日本大耳兔制備抗CyHV-2多克隆抗體，同時(shí)將純化的截短蛋白免疫鯽，通過(guò)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究截短表達(dá)蛋白的免疫原性，以期為抗CyHV-2新型疫苗的創(chuàng)制和CyHV-2免疫檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用異育銀鯽來(lái)自于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)基地，平均體重(158±18)g。暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫控制在(24±2)℃，連續(xù)充氣增氧，投喂商品化配合飼料。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)抽取部分鯽進(jìn)行CyHV-2檢測(cè)，確定魚(yú)體不帶有CyHV-2后用于試驗(yàn)。

1.2 病毒株、細(xì)胞系、菌株與質(zhì)粒

CyHV-2分離于江蘇某養(yǎng)殖場(chǎng)患病異育銀鯽，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定與保藏[2]。異育銀鯽腦組織細(xì)胞系(GiCB)由本實(shí)驗(yàn)室建立并保存[10]，培養(yǎng)基為含10% 新生牛血清的M199，培養(yǎng)溫度為28 ℃。E.coilDH5α菌株、E.coilBL21(DE3)菌株和克隆載體pMD19-T購(gòu)置于TaKaRa公司；表達(dá)載體pET32a+ 購(gòu)置于Novagen公司。

1.3 CyHV-2 ORF25截短基因的克隆

利用生物信息學(xué)軟件DNA Star 6.0(Protean)對(duì)CyHV-2(GenBank Access.No.KM200722.1)的ORF25 編碼蛋白進(jìn)行分析，針對(duì)該序列富含抗原表位的一段基因設(shè)計(jì)引物pET-CyHV-25JD-F：5′-CGGGATCCACTCAGAATACAACA-3′和pET-CyHV-25JD-R：5′-CCAAGCTTGTTTGCGCCGTATGG-3′，上、下游引物酶切位點(diǎn)分別是BamH I和HindⅢ。提取GiCB細(xì)胞培養(yǎng)的CyHV-2病毒核酸作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體后，轉(zhuǎn)化到E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)PCR和雙酶切鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pMD19-T-tORF25。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ和HindⅢ分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-tORF25和原核表達(dá)載體pET32a+進(jìn)行雙酶切。將酶切后的目的基因通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-tORF25，其菌株命名為pET-32a-tORF25/BL21。

1.5 截短表達(dá)蛋白的表達(dá)與純化

將重組菌pET-32a-tORF25/BL21接種于含0.05 g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日將菌體培養(yǎng)物以1∶100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm≈0.4，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以不加IPTG的菌液作為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)4 h后將菌液離心，取部分沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。 同時(shí)，剩余沉淀經(jīng)超聲波破碎后，通過(guò)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(上海，碧云天)純化截短表達(dá)蛋白tORF25。采用Bradford法對(duì)純化后截短表達(dá)蛋白tORF25的濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.6 多克隆抗體制備及效價(jià)測(cè)定

將0.6 mg截短表達(dá)蛋白tORF25與等量的弗氏完全佐劑混合后，以皮下多點(diǎn)注射的方式免疫日本大耳兔，陰性對(duì)照注射PBS。每間隔14 d加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次。在最后一次免疫后第7天采集兔血樣，分離血清。通過(guò)抗體親和純化得到純化的多克隆抗體。將純化的多克隆抗體稀釋1×103倍后，再進(jìn)行2倍等比稀釋至1∶64 000。將稀釋后不同濃度的多克隆抗體轉(zhuǎn)移至含100 μg/孔截短表達(dá)蛋白tORF25的96孔板中孵育，同時(shí)設(shè)置1×103倍稀釋后的陰性組血清作為陰性對(duì)照。將羊抗兔IgG(含HRP標(biāo)記)加入上述96孔板后，用四甲基苯胺(TMB)溶液顯色。測(cè)定各孔的OD450nm值，確定抗體效價(jià)。

1.7 Western blot分析

將誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)(陰性對(duì)照)的重組菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。以純化的多克隆抗體為一抗，參照ONE-HOUR WesternTM試劑盒(南京，金斯瑞)操作步驟對(duì)多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析。

1.8 間接免疫熒光檢測(cè)

用4% 多聚甲醛將感染CyHV-2后出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)的GiCB細(xì)胞固定。以純化的多克隆抗體為一抗，參照間接免疫熒光試劑盒-抗兔Cy3(上海，碧云天)操作步驟進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。

1.9 免疫保護(hù)率測(cè)定

免疫試驗(yàn)用異育銀鯽在恒溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為免疫組和對(duì)照組，每組30尾魚(yú)。將純化的重組蛋白tORF25用PBS稀釋至200 μg/mL。免疫組肌肉注射0.1 mL含有20 μg的截短蛋白tORF25。對(duì)照組注射等體積的PBS。接種截短蛋白tORF25后，免疫鯽養(yǎng)殖水溫保持在25 ℃，每天投喂鯽商品飼料。免疫后第21天用濃度為0.1 mg/mL MS-222將魚(yú)體麻醉后，通過(guò)腹腔注射滴度為100 TCID50/mL的CyHV-2，劑量為0.4 mL/尾。持續(xù)觀察28 d，每天記錄感染后情況，計(jì)算出截短表達(dá)蛋白tORF25免疫鯽后的相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)。計(jì)算公式為：

RPS=[1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×100%

1.10 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CyHV-2 ORF25截短蛋白編碼基因的克隆

利用生物軟件對(duì)CyHV-2 ORF25蛋白的抗原表位進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CyHV-2 ORF25編碼蛋白存在多個(gè)抗原表位。針對(duì)CyHV-2 ORF25蛋白第20-117位富含抗原表位的氨基酸編碼基因設(shè)計(jì)引物。從病毒基因組DNA中擴(kuò)增出大小為294 bp的基因片段，其測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。將擴(kuò)增產(chǎn)物tORF25進(jìn)行電泳回收后，連接到克隆載體pMD19-T上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞后，對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR和雙酶切檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，均在294 bp處有一條特異條帶，與預(yù)期的核酸片段大小相同(圖2)。結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-T-tORF25。

圖1 tORF25基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of tORF25 gene amplification1：陰性對(duì)照；2：tORF25基因；M：DL 2000 DNA Ladder

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T-tORF25鑒定結(jié)果

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒pMD19-T-tORF25和原核表達(dá)載體pET32a+雙酶切后，回收并連接目的基因。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。電泳結(jié)果顯示，均在294 bp處有一條特異條帶，與預(yù)期的核酸片段大小相同(圖3)。結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-tORF25，且獲得了含有該質(zhì)粒的E.coilBL21(DE3)原核表達(dá)菌株。

2.3 截短表達(dá)蛋白的表達(dá)與純化

原核表達(dá)菌株經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的原核表達(dá)菌株在28 kW處有一條明顯的亮帶，與預(yù)期蛋白大小一致，而未誘導(dǎo)的原核表達(dá)菌株在28 kW處未見(jiàn)明顯亮帶(圖4)。結(jié)果表明，原核表達(dá)菌株能有效地表達(dá)出截短表達(dá)蛋白tORF25。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-tORF25鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of recombinant expression plasmid pET-32a-tORF251：雙酶切；2：未酶切；3：PCR；4：陰性對(duì)照；M：DNA Marker DL 2000

圖4 原核表達(dá)菌株SDS-PAGE分析Fig.4 The strain analysis of procaryotic expression by SDS-PAGE1-2：未誘導(dǎo)；3-7：誘導(dǎo)；M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)

利用His標(biāo)簽吸附作用純化截短表達(dá)蛋白，并對(duì)純化的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定(圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明得到了高純度的截短表達(dá)蛋白。經(jīng)Bradford法測(cè)定截短表達(dá)蛋白的濃度為600 μg/mL。

圖5 純化后的重組tORF25蛋白Fig.5 Purified recombinant protein tORF251：純化后的截短表達(dá)蛋白；2：純化前的截短表達(dá)蛋白；M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)

2.4 截短表達(dá)蛋白多克隆抗體的制備及Western blot檢測(cè)

收集經(jīng)過(guò)5次免疫的日本大耳兔抗血清，抗血清經(jīng)抗體親和純化得到多克隆抗體，濃度為6.25 mg/mL。經(jīng)ELISA法測(cè)定，抗體效價(jià)大于1∶40 000。Western blot結(jié)果表明：多克隆抗體能特異性地結(jié)合截短表達(dá)蛋白tORF25(圖6)。

圖6 重組tORF25蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of expressed tORF25 protein with the polyclonal antibodies1：誘導(dǎo)；2：未誘導(dǎo)；M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.5 間接免疫熒光檢測(cè)

感染CyHV-2的GiCB細(xì)胞和未處理的正常GiCB細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定后，依次與多克隆抗體和紅色熒光探針標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育。熒光顯微鏡下觀察顯示，感染CyHV-2的GiCB細(xì)胞在綠光激發(fā)下呈現(xiàn)出鮮艷的紅色，而沒(méi)有感染CyHV-2的GiCB細(xì)胞則沒(méi)有紅色熒光出現(xiàn)(圖7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的抗截短蛋白tORF25的多克隆抗體能夠用于檢測(cè)CyHV-2。

圖7 免疫熒光檢測(cè)GiCB細(xì)胞中的CyHV-2Fig.7 Detection CyHV-2 in GiCB cells by the immunofluorescenceA：DAPI染色病變細(xì)胞；B：熒光顯微鏡下病變細(xì)胞；C：A和B融合圖；D：DAPI染色正常細(xì)胞；E：熒光顯微鏡下正常細(xì)胞；F：D和E融合圖(標(biāo)尺大?。?0微米)

2.6 免疫保護(hù)率

使用截短蛋白tORF25免疫異育銀鯽后，第21天進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)。攻毒后，免疫組與對(duì)照組鯽在28 d內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病死亡，發(fā)病時(shí)間集中在攻毒后的第10～22天，結(jié)果如圖8所示。免疫截短蛋白tORF25后，鯽產(chǎn)生了明顯的免疫力，tORF25截短蛋白免疫試驗(yàn)組的累計(jì)死亡率為46%，而PBS對(duì)照組的累計(jì)死亡率為87%(圖8)。依據(jù)公式計(jì)算，免疫截短蛋白tORF25免疫異育銀鯽后的相對(duì)免疫保護(hù)率為47%。攻毒試驗(yàn)中，試驗(yàn)魚(yú)發(fā)病死亡的臨床癥狀與自然感染CyHV-2的鯽臨床癥狀一致。采集攻毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)病死亡鯽的內(nèi)臟組織進(jìn)行PCR檢測(cè)，均顯示為CyHV-2陽(yáng)性，表明其死亡原因是由于人工注射感染CyHV-2所致。

圖8 攻毒后鯽的累計(jì)死亡率Fig.8 Cumulative mortality of gibel carp after challenge with live CyHV-2

3 討論

Li等[11]對(duì)我國(guó)鯽造血器官壞死癥流行株CyHV-2 SY-C1全基因組進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果顯示，該病毒由289 365個(gè)堿基對(duì)組成,G+C含量為51.7%。根據(jù)CyHV-2基因組序列預(yù)測(cè)出該病毒有開(kāi)放閱讀框約151個(gè)，這151個(gè)ORF編碼了構(gòu)成病毒自身所有的結(jié)構(gòu)和功能蛋白[11，12]。其中，CyHV-2的ORF25基因?qū)儆贠RF25多基因家族，編碼病毒的膜蛋白，含有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，具有較好的免疫原性[12,13]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，分析了ORF25編碼蛋白的抗原表位，篩選出富含抗原表位的區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)。表達(dá)的截短蛋白tORF25由CyHV-2 tORF25截短基因編碼蛋白和載體自身的標(biāo)簽蛋白組成。

利用原核表達(dá)蛋白制備抗體后，驗(yàn)證抗體與病毒的免疫反應(yīng)，是建立病毒免疫檢測(cè)方法的基本思路。已有研究表明，用原核表達(dá)的CyHV-2 ORF4，ORF5和ORF72蛋白制備的多克隆抗體能與CyHV-2發(fā)生特異性反應(yīng)[14-16]。彭俊杰等[13]用原核系統(tǒng)表達(dá)的CyHV-2 ORF25免疫小鼠后，通過(guò)細(xì)胞融合和ELISA實(shí)驗(yàn)篩選出1株能分泌抗CyHV-2 ORF25編碼蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體能與感染CyHV-2的GiCB細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。本研究用純化的截短表達(dá)蛋白tORF25免疫日本大耳兔，成功地制備了抗CyHV-2 ORF25截短基因編碼蛋白的特異性多克隆抗體。將該多克隆抗體與原核表達(dá)的tORF25蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示雜交條帶大小與預(yù)期蛋白大小一致，說(shuō)明該抗體特異性好。將該多克隆抗體與感染CyHV-2后發(fā)生病變的GiCB細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)病毒和抗體能特異性結(jié)合，而且結(jié)合效率高于CyHV-2 ORF4編碼蛋白制備抗體的結(jié)合效率[16]，表明該多克隆抗體可用于CyHV-2的免疫診斷。通過(guò)抗ORF25編碼蛋白多克隆抗體建立的CyHV-2間接免疫熒光診斷方法，豐富了CyHV-2的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

廖紅等[15]將原核表達(dá)的CyHV-2 ORF5編碼蛋白免疫鯽后，使用CyHV-2進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示表達(dá)蛋白的相對(duì)免疫保護(hù)率最高為35%。而本研究將截短表達(dá)蛋白tORF25注射鯽后接種CyHV-2，其相對(duì)免疫保護(hù)率為47%，高于CyHV-2 ORF5編碼蛋白免疫鯽后的保護(hù)率。但對(duì)于疫苗產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，47%的保護(hù)率并不理想，這可能是由于原核表達(dá)的蛋白缺少糖基化修飾等原因所致，尚需進(jìn)一步優(yōu)化與改進(jìn)。

綜上所述，本研究中原核表達(dá)的CyHV-2截短蛋白tORF25具有較好的免疫原性，同時(shí)利用截短蛋白制備出具有較好特異性的抗CyHV-2多克隆抗體，為抗CyHV-2新型疫苗的創(chuàng)制和免疫檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。