陳春山，魏 凱,韓姝伊，鄭 偉，郭明磊，董 穎，胡紅霞

(1.北京市水生野生動植物救護(hù)中心，北京102100；2.中國科學(xué)院動物研究所，北京100101；3.河北師范大學(xué)，石家莊050024；4.吉林省延邊自治州水產(chǎn)站，吉林延吉133001；5.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京100068)

魚類染色體組操作是遺傳育種工作的重點研究領(lǐng)域之一。在多倍體魚中，三倍體魚因染色體組成不平衡，性腺不能發(fā)育成熟，避免了性腺發(fā)育時期生長停滯和魚肉質(zhì)量下降等不利影響，對控制過度繁殖、增加生長速率、延長成熟魚的壽命以及提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和魚肉質(zhì)量具有重要的意義[1-3]，也是魚類育種方面研究的熱點之一。國內(nèi)外在魚類三倍體育種方面已成功誘導(dǎo)出斑馬魚(Brachydaniorerio)[4]、黑鯛(Sparusmacrocephlus)[5]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[6]等40多種魚類。三倍體湘云鯽(Triploid Crucian Carp)[7]、興國紅鯉(Cyprinuscarpiovarsinguonensis)[8]已進(jìn)入實用化生產(chǎn)階段。

細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)是我國名貴的鮭科冷水性魚類，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[9]。由于環(huán)境變化和人類活動干擾等原因，細(xì)鱗鮭的自然資源量急劇下降，分布區(qū)域縮小。近年來，細(xì)鱗鮭的資源保護(hù)和人工增殖受到高度重視，很多學(xué)者對其主要分布水域的生物學(xué)特性和繁殖生態(tài)學(xué)進(jìn)行了調(diào)查研究[10]，細(xì)鱗鮭全人工繁殖研究也取得成功[11-13]。但由于細(xì)鱗鮭幼魚生長速度較慢，繁殖后親魚死亡率較高，特別是雄性親魚產(chǎn)后死亡率最高可達(dá)80%以上，影響了規(guī)?；a(chǎn)。為更好地解決細(xì)鱗鮭在推廣過程中的瓶頸，根據(jù)三倍體魚具有不育、個體大、生長快、壽命長、成活率高等優(yōu)良品性，本研究參考了虹鱒[14](Oncorhynchusmykiss)、金鱒[15](OncorhynchusmykissWalbaum)、硬頭鱒[16](Oncorhynchusmykiss) 、大西洋鮭[17](Salmosalar)等鮭科魚類三倍體誘導(dǎo)結(jié)果，采用熱休克法進(jìn)行了細(xì)鱗鮭三倍體誘導(dǎo)技術(shù)實驗，探討細(xì)鱗鮭三倍體魚誘導(dǎo)的可能性，為進(jìn)一步開展三倍體與二倍體對比實驗和規(guī)模化生產(chǎn)三倍體苗種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與養(yǎng)殖管理

實驗用親魚采自吉林省琿春細(xì)鱗鮭水產(chǎn)良種場，年齡為5+齡，規(guī)格為(1 500±125)g(♀)，(1 100±89)g(♂)。其中，雌性親魚27尾，共采卵118 395粒。細(xì)鱗鮭三倍體誘導(dǎo)實驗及受精卵的孵化在琿春細(xì)鱗鮭水產(chǎn)良種場養(yǎng)殖車間進(jìn)行，后期將部分實驗魚苗運(yùn)至北京市水生野生動植物救護(hù)中心養(yǎng)殖基地進(jìn)行飼養(yǎng)管理。每個養(yǎng)殖水槽放置1 000尾魚苗，養(yǎng)殖用水為曝氣后的地下水，溶氧>8 mg/L，pH 8.0～8.4，每天投喂5次，日投喂量按照體重的5%～7%計算，每天上午10點和下午4點吸污一次，養(yǎng)殖150 d后進(jìn)行倍性檢測。

1.2 受精與孵化

選擇性腺發(fā)育成熟的細(xì)鱗鮭。雄性身體瘦長，體兩側(cè)和腹部顏色發(fā)黑，有暗紅色斑紋，生殖孔凹陷，后期輕壓腹部有少量乳白色精液流出；雌性體型豐滿，腹部圓潤，體兩側(cè)和腹部白色，無紅色斑紋，后期生殖孔紅腫外凸。選擇發(fā)育良好，副性征明顯，規(guī)格整齊，體表無傷的親魚催產(chǎn)，催產(chǎn)藥物L(fēng)HRH-A2和DOM組合(寧波第二激素廠)，劑量為雌魚2.5 μg/kg LHRH-A2+2.5 mg/kg DOM，雄魚減半，一次性注射。干法受精獲得受精卵。水源為山泉水，受精水溫8.7 ℃，孵化水溫為7.6-12 ℃，平均10.25 ℃。采卵與孵化具體方法參照陳春山等[13]方法進(jìn)行，其中受精卵達(dá)到160 ℃·d開始發(fā)眼，達(dá)到260 ℃·d開始破膜(圖1)。

圖1 細(xì)鱗鮭發(fā)眼卵Fig.1 Eyed eggs of Brachymystax lenok

1.3 三倍體誘導(dǎo)

參考虹鱒等鮭科魚類三倍體最佳誘導(dǎo)條件，實驗共分為6組，設(shè)計了24、26、28 ℃三個誘導(dǎo)溫度。重點進(jìn)行了26 ℃的誘導(dǎo)實驗，包括15、20 min二個起始誘導(dǎo)時間，10、20 min二個持續(xù)誘導(dǎo)時間。24 ℃和28 ℃僅選擇最優(yōu)處理條件進(jìn)行比較。每組設(shè)3個重復(fù)，設(shè)一個對照組。實驗參數(shù)見表1。

表1 熱休克誘導(dǎo)細(xì)鱗鮭三倍體實驗參數(shù)Tab.1 Experiment parameters of heat shock induced triploid of B.lenok

熱休克處理在電子恒溫水浴鍋中進(jìn)行，水溫誤差≤0.5 ℃，靈敏度0.1 ℃。將受精卵放于直徑15 cm的不銹鋼漏網(wǎng)中，先在水溫20 ℃的水浴鍋中過渡1 min，再放入設(shè)定處理水溫的水浴鍋中，輕輕晃動漏網(wǎng)，使受精卵盡快與周圍水溫相一致。熱處理后受精卵直接放入8.7 ℃孵化水溫的容器中，處理后2～4 h期間檢出死卵，放入桶中孵化。對照組受精后2～4 h期間挑出死卵直接放入孵化桶孵化。

1.4 倍性檢測

采用 Pactec CyFlow Cube 8 型流式細(xì)胞儀檢測魚苗血液 DNA 相對含量的方法確定三倍體率。魚苗培育至(5.86±0.99)cm，試驗組每組隨機(jī)采樣30尾，斷尾抽血，每次檢測 3 尾二倍體魚苗作為對照，上述實驗在北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所進(jìn)行。綜合評分[6]按三倍體率和發(fā)眼率之和為100%，三倍體率占40%，發(fā)眼率占60%。若三倍體率與發(fā)眼率中有一項為零，則綜合評分為零。

1.5 數(shù)據(jù)分析

受精卵熱處理后2～4 h期間挑出死卵，計算死亡率。孵化發(fā)眼后挑出未發(fā)眼卵，統(tǒng)計發(fā)眼率。孵化后檢出未出膜卵，統(tǒng)計孵化率。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理，再用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，其中，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)時間對實驗結(jié)果的影響

卵子受精后15、20 min，熱處理10、20 min均可誘導(dǎo)出細(xì)鱗鮭三倍體魚，各實驗組間發(fā)眼率、孵化率、4 h死亡率、三倍體率差異顯著(表2)。在處理溫度相同(26 ℃)，持續(xù)處理時間都是10 min條件下(2組和4組)，起始受精時間不同(15 min和20 min)，4 h死亡率和孵化率無顯著差異(P>0.05)，發(fā)眼率和三倍體率有顯著差異，起始處理時間20 min組高于15 min組。在處理溫度相同(26 ℃)，持續(xù)處理時間都是20 min條件下(3組和5組)，起始受精時間不同(15 min和20 min)，4 h死亡率、發(fā)眼率、孵化率和三倍體率均存在顯著差異(P<0.05)，起始處理時間20 min組高于15 min組。在處理溫度(26 ℃)相同，起始受精時間(15 min或20 min)相同，持續(xù)處理時間(10 min和20 min)不同，4 h死亡率、發(fā)眼率、孵化率、三倍體率存在顯著差異(P<0.05)。與二倍體的對照組相比，各實驗組4 h死亡率顯著高于對照組，孵化率顯著低于對照組，發(fā)眼率除5組外也與對照組差異顯著。

2.2 誘導(dǎo)溫度對實驗結(jié)果的影響

24、26、28 ℃三個處理溫度均可獲得三倍體魚(表2)。受精卵經(jīng)不同溫度熱休克處理后，各實驗組4 h死亡率差異較大，都與對照組差異極顯著。死亡率最高的是28 ℃組達(dá)(21.76±0.12)%，其次是24 ℃組達(dá)(12.57±0.24)%，最低是26 ℃組[(4.71±0.15)%～(8.31±0.64)%]，2組和4組無顯著差異。經(jīng)過熱處理后的4 h死亡率明顯高于對照組的死亡率，表明熱休克處理對細(xì)鱗鮭受精卵的影響比較大。

6個實驗組發(fā)眼率均較高(78.18±0.23)%～(92.62±0.74)%，除5組和對照組組間無顯著差異外，各實驗組間及與對照組差異均極顯著。處理溫度對孵化率影響差異較大，第6組孵化率最低(25.63±0.17)%，1～5組都在82%以上，都與對照組差異顯著。

表2 熱休克誘導(dǎo)細(xì)鱗鮭三倍體實驗結(jié)果Tab.2 Experiment results of triploid induction by heat shock

注：a,b,c,d,e,f：同列中不同上標(biāo)字母表示各組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 細(xì)鱗鮭DNA含量及三倍體誘導(dǎo)率

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測分析結(jié)果顯示，二倍體細(xì)鱗鮭的DNA相對含量為50左右(見圖2)，三倍體細(xì)鱗鮭的DNA相對含量為75左右(見圖3)，圖4為二倍體與三倍體血液混合后測定的DNA相對含量結(jié)果。6個實驗組間三倍體率差異顯著(見表2)，最低為24℃實驗組的48.25%；最高為26℃、起始受精時間為20 min、持續(xù)處理時間為20 min實驗組的95.45%。綜合評分結(jié)果表明第5組為最佳誘導(dǎo)條件(見表3)。

圖2 二倍體細(xì)鱗鮭DNA含量Fig.2 DNA content of diploid B.lenok

圖3 三倍體細(xì)鱗鮭DNA含量Fig.3 DNA content of triploid B.lenok

3 討論

3.1 誘導(dǎo)起始時間與持續(xù)時間的確定

根據(jù)魚類受精細(xì)胞學(xué)的研究，抑制第二極體的排放可以使染色體加倍形成三倍體受精卵,因此，對誘導(dǎo)時間的把握尤為重要。不同魚類第二極體的排放時間不同，國內(nèi)養(yǎng)殖較多的經(jīng)濟(jì)魚類，如草魚、白鰱、錦鯉等第二極體的排放大多在受精后3～8 min[18-20]，而冷水性魚類較遲緩，如鮭科魚類第二極體的排放大多在受精后15～40 min[21-23]。在這個時間用熱休克法處理，是獲得染色體加倍的最佳時機(jī)。張艷萍等[24]認(rèn)為，虹鱒受精卵發(fā)育至15 min時，是熱休克處理的敏感期，在此期間第二極體已經(jīng)形成但尚未排出細(xì)胞外，是獲得三倍體的最佳時期，其中處理持續(xù)時間為主要影響因素。吳玉萍等[4]分析了熱休克處理斑馬魚的參數(shù)與三倍體出現(xiàn)率和胚胎相對存活率的關(guān)系，認(rèn)為誘導(dǎo)參數(shù)中起始誘導(dǎo)時間為重要因素，其次為持續(xù)時間和誘導(dǎo)溫度。在本實驗條件下，細(xì)鱗鮭在受精后15 min、20 min通過熱休克處理都能獲得三倍體，表明細(xì)細(xì)鱗鮭卵子的熱敏感期較長，閾值較大。同種魚類由于卵的成熟度差異和受精水溫不同，受精卵的胚胎發(fā)育快慢程度也不同，因此選擇起始誘導(dǎo)時間應(yīng)考慮受精時水溫的因素。

圖4 二倍體和三倍體細(xì)鱗鮭DNA相對含量Fig.4 Relative DNA content of diploid and triploid B.lenok

組別發(fā)眼率/%三倍體率/%評分結(jié)果184.1948.2569.81278.1868.5374.32389.7390.0689.86485.8374.1781.17592.6295.4593.75679.2257.6270.58對照93.0800

此外，在溫度休克試驗中另外一項重要因素是誘導(dǎo)持續(xù)時間的確定。樓允東[25]認(rèn)為溫度休克誘導(dǎo)三倍體技術(shù)中，隨著持續(xù)時間的增加(在一定的處理時間范圍內(nèi))，誘導(dǎo)率也在增加。宋立民等[26]研究發(fā)現(xiàn)三倍體的產(chǎn)生需要一個適度的外界刺激以阻止第二極體的釋放。刺激強(qiáng)度太小，不能夠阻止大多數(shù)卵子染色體組的遷移，只能產(chǎn)生少量三倍體。刺激強(qiáng)度過大，則會使染色體斷裂或丟失，形成非整倍體，胚胎受到損害，存活率大大降低。本實驗條件下持續(xù)處理10 min和20 min，均可獲得細(xì)鱗鮭三倍體魚，在其他條件相同情況下，處理20 min三倍體率和發(fā)眼率高于處理10 min的三倍體率和發(fā)眼率。由此我們認(rèn)為10～20 min屬于正常的刺激強(qiáng)度范圍，且誘導(dǎo)率與持續(xù)時間呈正相關(guān)。下一步，我們將著重探討影響細(xì)鱗鮭受精卵存活的持續(xù)時間上限閾值。

3.2 誘導(dǎo)溫度的確定

王炳謙等[14]采用熱休克誘導(dǎo)全雌虹鱒魚三倍體，受精卵經(jīng)26 ℃處理的誘導(dǎo)效果好于24 ℃和28 ℃的，與本實驗結(jié)果相同。在26.5 ℃水溫、受精后20 min，28 ℃處理20 min，三倍體率13.33%，4 h死亡率39.59%，發(fā)眼率19.1%，孵化率2.59%。同樣的時間條件下，采用26 ℃處理，獲得三倍體率86.67%，4 h死亡率18.21%，發(fā)眼率71.65%，孵化率64.62%。張艷萍等[24]采用三個不同溫度(26.5、28、30 ℃)進(jìn)行虹鱒三倍體誘導(dǎo)處理，均成功產(chǎn)生虹鱒三倍體，隨著誘導(dǎo)溫度的升高、處理持續(xù)時間的延長，虹鱒受精卵2 h內(nèi)死亡率逐漸上升；在30 ℃處理持續(xù)時間超過10 min的條件下，虹鱒受精卵全部死亡或停止發(fā)育，認(rèn)為30 ℃臨近虹鱒發(fā)眼卵的致死溫度。Dube等[23]用22、24、26 ℃熱刺激美洲紅點鮭產(chǎn)生的三倍體率極低(0～20%)，27～33 ℃最高可獲得100%的三倍體率，但存活率差異很大。

結(jié)合國內(nèi)學(xué)者對虹鱒及其它鮭科魚類進(jìn)行熱休克誘導(dǎo)的研究結(jié)果，適宜的處理溫度是保證細(xì)鱗鮭三倍體誘導(dǎo)成功的重要前提，而最佳誘導(dǎo)溫度可能在26 ℃左右，且隨著溫度的升高，受精卵的成活率會降低。因此，我們重點進(jìn)行了26 ℃組的實驗分析，同時選擇24℃和28℃時誘導(dǎo)率較好的處理條件進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，24、26、28 ℃三個處理溫度均可獲得三倍體細(xì)鱗鮭個體，但三倍體率差異顯著。在此基礎(chǔ)上，對2～4 h死亡率、發(fā)眼率、孵化率幾個因素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組存在顯著差異。其中，溫度對2～4 h死亡率影響最明顯，28 ℃組死亡率最高，其次是24 ℃組，26 ℃組最低。溫度對發(fā)眼率影響較小，對孵化率有一定影響。因此，誘導(dǎo)溫度是影響本實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素。26 ℃處理結(jié)果好于24 ℃和28 ℃，該結(jié)果與實驗設(shè)計預(yù)期結(jié)果相同。

3.3 熱休克誘導(dǎo)細(xì)鱗鮭的最佳條件

本試驗按照Gervai等[27]評分標(biāo)準(zhǔn)，初步確定細(xì)鱗鮭熱休克誘導(dǎo)三倍體的最佳條件是受精后20 min，26 ℃處理20 min，與虹鱒[14]、金鱒[15]誘導(dǎo)最佳條件接近。與其它魚類的研究成果對比，Xu等[28]采用冷休克法誘導(dǎo)牙鲆三倍體，三倍體率高達(dá)100%，且最高成活率為93.27%；張艷萍等[24]實驗結(jié)果，在26.5 ℃下，受精后15 min起始處理10 min，誘導(dǎo)虹鱒三倍體效果最佳，發(fā)眼率為79.32%，誘導(dǎo)率達(dá)到83.18%。上述不同魚類溫度休克敏感性的差異不僅與遺傳背景有關(guān)，還與卵子成熟度有關(guān)。一般來講，動物的遺傳背景及卵子的成熟度使得不同動物甚至同一動物在不同試驗環(huán)境的最佳誘導(dǎo)條件都會發(fā)生變化。