黃倩倩，溫彬宇，閆 妍，趙永烈，馬 濤

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦病科，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，北京 100078)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)起病隱匿，是一種以進(jìn)行性記憶力喪失、認(rèn)知功能障礙、人格和行為異常等為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要病理改變包括以β淀粉樣蛋白(amyloid β, Aβ)沉積為主要成分的老年斑(senile plaque, SPs)和異常磷酸化Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是細(xì)胞針對外界損傷的一種保護(hù)性機(jī)制，在AD病程中，Aβ和NFTs的過度累積均可激活ERS，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)，進(jìn)而激活自噬，清除錯誤折疊蛋白[2]。大量研究顯示，在AD中，由于ERS的持續(xù)激活及自噬功能障礙，導(dǎo)致過量累積的Aβ與NFTs不能被有效清除，從而造成神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致認(rèn)知記憶功能障礙[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ERS與自噬的交互作用在AD發(fā)病及治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，成為AD治療的重要潛在靶標(biāo)，受到日益關(guān)注。本文主要針對近年來ERS與自噬交互作用在AD發(fā)病及防治中的作用機(jī)制及研究進(jìn)展做一綜述。

1 ERS與AD

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)膜蛋白合成、初始翻譯后修飾、折疊和分泌的細(xì)胞器。當(dāng)未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能過載時，會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)ERS，進(jìn)而激活UPR，引發(fā)下游一系列反應(yīng)[4]。UPR分別由3個跨膜感受蛋白介導(dǎo)的通路啟動，這3個蛋白分別是蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶[protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase, PERK]、肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)。在正常生理狀態(tài)下，這3種蛋白均與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)結(jié)合，保持無活性狀態(tài)。ERS發(fā)生時，PERK、IRE1α、ATF6與GRP78解離并被激活，啟動UPR，上調(diào)包括分子伴侶在內(nèi)的UPR相關(guān)基因表達(dá)，下調(diào)總體蛋白質(zhì)翻譯水平，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞功能[5]。

大量研究證明，ERS是AD的核心病變。在AD患者大腦中，ERS標(biāo)志物GRP78水平明顯增高，并且與AD患者的Braak分期呈正相關(guān)；UPR中關(guān)鍵蛋白，包括磷酸化的PERK、真核翻譯啟始因子2α(eucaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)、IRE1α等水平，在AD患者腦中均明顯增加。研究表明，UPR發(fā)生在AD早期階段，隨著病情加重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)持續(xù)失衡，適應(yīng)性、保護(hù)性ERS逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性、損傷性ERS，造成神經(jīng)元凋亡和突觸缺失，損害認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力[3]。Marcora等[6]發(fā)現(xiàn)，伴隨著AD模型果蠅的衰老，UPR的保護(hù)作用減弱，而PERK持續(xù)磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)變性損傷明顯增強(qiáng)，ERS由適應(yīng)性、保護(hù)性向持續(xù)性、損傷性轉(zhuǎn)變。AD患者及模型小鼠腦中，eIF2α持續(xù)磷酸化導(dǎo)致的持續(xù)性ERS，可抑制突觸蛋白的合成，降低神經(jīng)突觸可塑性，加重記憶功能障礙[7]。

Aβ的毒性積聚是AD病變的重要因素，Aβ的過量累積可導(dǎo)致SPs形成，造成突觸缺失、神經(jīng)功能失調(diào)和神經(jīng)元死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境與Aβ產(chǎn)生和加工密切相關(guān)，Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)通過β-分泌酶1(beta-secretase 1, BACE1)和γ-分泌酶依次剪切形成的短肽。正常細(xì)胞中，APP與GRP78結(jié)合，從而抑制Aβ產(chǎn)生；而在AD病理狀態(tài)下，由于ERS失衡，APP轉(zhuǎn)運(yùn)異常，造成APP的異常積聚。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，衣霉素誘導(dǎo)的ERS使AD模型細(xì)胞UPR被激活，APP水平下降；但當(dāng)ERS平衡破壞后，BACE1和γ-分泌酶復(fù)合物的核心組分-早老素1(presenilin 1，PS1)的表達(dá)會隨之上調(diào)，致使Aβ生成增加，并進(jìn)一步累積。在AD模型小鼠中，隨著eIF2α磷酸化水平的增高，活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)和BACE1的表達(dá)水平也隨之上升，Aβ生成和SPs沉積明顯增加[9]。

PS1基因突變是AD的重要遺傳致病因素，可以對ERS產(chǎn)生多種影響。PS1突變可以使GRP78的水平降低，抑制IRE1α、PERK的自身磷酸化和減弱ATF6信號通路，進(jìn)而削弱UPR保護(hù)作用，導(dǎo)致ERS失衡，增加神經(jīng)元對ERS損傷的易感性，進(jìn)一步加重AD病理損傷[3]。Genereux等[10]發(fā)現(xiàn)在AD中，ERS激活A(yù)TF6信號通路后，PS1突變使分子伴侶ERdj3(ER-localized DnaJ homolog 3)的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致Aβ分泌到胞外，并形成毒性聚集，破壞神經(jīng)元功能，進(jìn)而削弱UPR對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的再平衡作用。

2 自噬與AD

細(xì)胞自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，降解錯誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器的重要代謝過程，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自我更新的一種重要機(jī)制[3]。自噬根據(jù)降解途徑的不同分為3類，即分子伴侶介導(dǎo)的自噬 (chaperon-mediated autophagy，CMA)、微自噬(microautophagy)和巨自噬(macroautophagy)。巨自噬主要通過自噬溶酶體來清除錯誤折疊蛋白質(zhì)，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，本文所涉及的自噬主要是巨自噬。巨自噬對于神經(jīng)元維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，影響其功能的關(guān)鍵步驟主要是自噬體在神經(jīng)元內(nèi)的運(yùn)輸，以及自噬體與溶酶體的融合。自噬過程受到多種信號通路的調(diào)控。

自噬功能障礙與AD發(fā)病過程密切相關(guān)，自噬是清除異常錯誤蛋白聚集體的重要途徑，健康神經(jīng)元中的自噬囊泡通過與溶酶體結(jié)合，降解錯誤蛋白；而在AD中，自噬功能出現(xiàn)障礙，自噬囊泡大量累積，這可能是Aβ和磷酸化Tau蛋白異常累積的重要原因[11]。自噬溶酶體系統(tǒng)是Aβ的主要降解途徑，在正常情況下，Aβ被自噬囊泡包裹后，自噬囊泡沿軸突的微管系統(tǒng)逆向運(yùn)輸?shù)饺苊阁w部位，與之融合并降解Aβ。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者中樞神經(jīng)元的部分軸突和樹突部位，自噬囊泡由于運(yùn)輸障礙導(dǎo)致大量堆積，造成自噬功能損傷，使軸突和樹突部位異常腫脹[15]。同時，溶酶體功能障礙也是導(dǎo)致AD自噬功能障礙的重要原因，會造成自噬系統(tǒng)降解Aβ能力下降，Aβ無法有效清除而積聚，從而加劇AD病理損傷。研究表明，在溶酶體特異性水解酶組織蛋白酶B(cathepsin B)基因敲除小鼠腦中，Aβ產(chǎn)生明顯增多；在AD患者及模型動物腦中，溶酶體功能異常往往出現(xiàn)于Aβ形成和AD臨床癥狀出現(xiàn)之前，提示溶酶體功能損傷導(dǎo)致的自噬障礙發(fā)生在AD早期[12]。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3蛋白[microtubule-associated protein 1 (MAP1) light chain 3, LC3]和自噬激活蛋白Beclin-1等參與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白，均與AD的發(fā)生存在密切關(guān)系。mTOR對自噬發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，抑制mTOR，可以啟動細(xì)胞自噬反應(yīng)。Aβ沉積可以誘導(dǎo)mTOR信號激活，從而抑制自噬反應(yīng)。通過mTOR誘導(dǎo)的自噬可以清除Aβ毒性蛋白質(zhì)聚集體，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，是AD防治的重要靶標(biāo)。 Majumder等[13]發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR可以激活自噬通路，使UNC-51樣激酶1(UNC-51 like kinase 1, ULK1)激酶復(fù)合物去磷酸化后激活，招募磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)復(fù)合物到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。使自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related, ATG)12與 ATG5蛋白偶聯(lián)，進(jìn)而使LC3-I蛋白與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-II，形成自噬小體，清除Aβ蛋白沉積和Tau形成的NFTs，減輕認(rèn)知功能損傷。Beclin-1是激活自噬過程的重要調(diào)控因子，在Beclin-1敲除小鼠受影響的大腦區(qū)域中，神經(jīng)元的自噬調(diào)節(jié)被破壞，影響APP代謝，導(dǎo)致細(xì)胞外Aβ蛋白異常沉積，提示上調(diào)Beclin-1對防止AD早期病變發(fā)揮重要作用。

Fig 1 Crosstalk of ERS and autophagy in AD progress

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的交互作用與AD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

ERS下的大量錯誤折疊蛋白累積引起的UPR可激活細(xì)胞自噬，而細(xì)胞自噬通過降解錯誤蛋白，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，反過來抑制ERS，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存。由此，ERS與自噬的適度激活形成了機(jī)體內(nèi)適應(yīng)性、保護(hù)性的交互作用[14]。在AD發(fā)病過程中，這種適應(yīng)性、保護(hù)性的交互作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N持續(xù)性、破壞性的交互作用(Fig 1)。其中，PERK、IRE1α及ATF6信號通路介導(dǎo)的ERS和自噬的交互效應(yīng)，在AD發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的核心作用(Fig 2)。

Fig 2 Pathways involved in crosstalk between ERS

3.1PERK/eIF2α介導(dǎo)的ERS和自噬交互作用許多研究證明，PERK/eIF2α途徑是介導(dǎo)ERS與自噬交互作用的重要調(diào)控因子。Rouschop等[15]發(fā)現(xiàn)，PERK信號通路激活的ATF4和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologuous protein, CHOP)，能夠上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3B和ATg5基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)自噬體的形成。ERS還能夠通過eIF2α-ATF4-CHOP途徑，調(diào)控自噬蛋白ATG12，促使 LC3I轉(zhuǎn)變?yōu)?LC3II，誘發(fā)細(xì)胞自噬。PERK是激活eIF2α的重要激酶，與細(xì)胞的自噬反應(yīng)密切相關(guān)。在AD中，持續(xù)性ERS激活PERK-eIF2α信號通路，磷酸化eIF2α上的51位絲氨酸，下調(diào)總體蛋白質(zhì)翻譯水平；激活的eIF2α上調(diào)ATF4 mRNA，進(jìn)而上調(diào)CHOP等轉(zhuǎn)錄因子，抑制抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Beclin-1表達(dá)，從而導(dǎo)致自噬啟動[9]。Urra等[16]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性ERS使CHOP持續(xù)上調(diào)，通過抑制Bcl-2和上調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)蛋白x(Bcl-2-associated x, Bax)、Bcl-2同源拮抗蛋白(Bcl-2 homologous antagonist/killer, Bak),加速細(xì)胞凋亡，加重AD相關(guān)的神經(jīng)變性和記憶障礙。持續(xù)性ERS導(dǎo)致eIF2α過度磷酸化，使細(xì)胞總體蛋白質(zhì)合成下降，損害神經(jīng)功能；同時上調(diào)BACE1，導(dǎo)致Aβ過量產(chǎn)生和SPs沉積[17]。在AD轉(zhuǎn)基因小鼠中，持續(xù)性激活的PERK-eIF2a能夠上調(diào)BACE1的表達(dá)，影響APP的加工過程，增加Aβ的沉積；累積的Aβ反過來進(jìn)一步激活ERS，加重神經(jīng)損傷[18]。AD中持續(xù)性自噬損傷導(dǎo)致Aβ降解能力下降，造成Aβ累積增加，反過來也會加重ERS。Ohta等[19]發(fā)現(xiàn)，Atg5基因敲除的HEK293細(xì)胞由于自噬功能障礙，會激活PERK/eIF2α途徑，導(dǎo)致ATF4激活，上調(diào)PS1表達(dá)，提高γ-分泌酶活性，增加Aβ生成，造成ERS持續(xù)激活。

3.2IRE1α介導(dǎo)的ERS和細(xì)胞自噬交互作用IRE1α信號通路介導(dǎo)的ERS和自噬的交互作用，與AD的病理過程密切相關(guān)。IRE1α是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的I型跨膜蛋白，在通過自身二聚化和磷酸化激活后，IRE1α對無活性的X-盒結(jié)合蛋白1(X box binding protein-1, XBP1)mRNA進(jìn)行加工，使其翻譯成有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1，可調(diào)節(jié)多個UPR靶基因的表達(dá)。另外，IRE1α信號通路激活的XBP1可增加ER中伴侶分子的表達(dá)，促進(jìn)錯誤蛋白質(zhì)的折疊和降解，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。ERS激活的IRE1α信號通路與自噬的激活密切相關(guān)。IRE1α激活后，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF-2)結(jié)合，募集凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)，隨后激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)，進(jìn)而磷酸化Bcl-2，激活Beclin-1，誘發(fā)自噬反應(yīng)。在AD中，由于Bcl-2磷酸化失活，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，加重AD神經(jīng)損傷。Vogel等[20]發(fā)現(xiàn)，ASK1介導(dǎo)的JNK激活后，還可調(diào)節(jié)APP的加工，增加細(xì)胞內(nèi)Aβ的積累，導(dǎo)致神經(jīng)損傷。但同時在ERS中，XBP1與轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的結(jié)合，會對自噬起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Safra等[21]研究發(fā)現(xiàn)，秀麗線蟲AD模型中，敲除XBP1基因，可以上調(diào)自噬，減少Aβ毒性累積造成的損傷，表明XPB1是AD治療的重要潛在靶標(biāo)。另外，XBP1還可以與γ-分泌酶復(fù)合體的負(fù)性調(diào)控因子UBQLN1基因啟動子結(jié)合，控制APP的分裝與加工，影響Aβ的生成。

3.3ATF6介導(dǎo)的ERS和細(xì)胞自噬交互作用ATF6信號通路在ERS與自噬的交互作用中發(fā)揮著重要作用。ATF6是II型跨膜蛋白，屬于亮氨酸拉鏈家族(bZIP)結(jié)構(gòu)域中的轉(zhuǎn)錄因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，與GRP78結(jié)合而保持非活性狀態(tài)。ERS發(fā)生后，去除 GRP78的ATF6被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體上，在高爾基體內(nèi)，ATF6被特定的蛋白酶S1P(site 1 protease)和S2P(site 2 protease)切割后激活，之后移位到核內(nèi)，參與調(diào)控多個UPR相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，ATF6激活后，可以上調(diào)UPR相關(guān)蛋白GRP78和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein 94, GRP94)基因的表達(dá)，減弱神經(jīng)元對ERS易感性，保護(hù)神經(jīng)元，改善認(rèn)知功能水平，顯示ATF6可以做為AD潛在治療靶標(biāo)。有研究表明，在ERS導(dǎo)致的UPR中，ATF6上調(diào)死亡相關(guān)蛋白激酶1(death-associated protein kinase 1, DAPK1)，激活的DAPK1磷酸化Beclin-1，促進(jìn)其與Bcl-2解離，激活自噬，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。ATF6的激活上調(diào)DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3)的表達(dá)，DDIT3可與自噬相關(guān)蛋白LC3B基因上游-253-99啟動子區(qū)結(jié)合，上調(diào)LC3B的表達(dá)，促進(jìn)自噬。當(dāng)AD發(fā)生時，持續(xù)性激活的ERS，導(dǎo)致ATF6信號通路受損，致使分子伴侶ERdj3的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致Aβ生成增加，破壞神經(jīng)元功能，加重AD病理損傷[10]。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，ERS與自噬廣泛參與了AD的生理和病理過程，兩者的交互作用與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。ERS與自噬適應(yīng)性、保護(hù)性的交互作用可以幫助細(xì)胞清除毒性蛋白聚集體，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)失衡壓力，恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在AD中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的持續(xù)失衡和自噬功能障礙，導(dǎo)致ERS與自噬之間的上述交互作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N持續(xù)性和破壞性的交互作用。AD中，自噬功能障礙導(dǎo)致Aβ及NFTs降解下降并異常累積，反過來進(jìn)一步加重ERS的持續(xù)激活。首先，功能障礙的自噬長時間過度激活，導(dǎo)致自噬囊泡不斷聚積，被損害的自噬溶酶體系統(tǒng)面臨重大負(fù)荷，損傷神經(jīng)元；其次，eIF2α的持續(xù)磷酸化，使蛋白總體合成減少，導(dǎo)致神經(jīng)元正常生理活動受阻，損害神經(jīng)系統(tǒng)功能，如eIF2α的持續(xù)磷酸化可使突觸相關(guān)蛋白表達(dá)下降，破壞突觸可塑性[7]；再次，eIF2α的持續(xù)磷酸化導(dǎo)致BACE1上調(diào)，使Aβ產(chǎn)生增加和過量累積形成SPs，破壞神經(jīng)功能；最后，ERS與自噬的惡性循環(huán)激活凋亡信號通路，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，加重神經(jīng)變性，推動AD病程惡化(Fig 1)。

由于ERS與自噬持續(xù)性、破壞性的交互作用在AD發(fā)生及進(jìn)展中的核心作用，因此成為當(dāng)前AD防治極有價值的潛在靶標(biāo)，為AD治療和干預(yù)開辟了新的思路。針對PERK/eIF2α通路調(diào)控，Halliday等[22]發(fā)現(xiàn)ATF4抑制劑ISRIB可以下調(diào) ATF4表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞蛋白合成水平，明顯提高大鼠的認(rèn)知能力，且ISRIB能透過血腦屏障，表現(xiàn)出良好的生物利用度。小分子物質(zhì)Salubrinal和Sephin 1通過阻止eIF2α磷酸化，抑制ERS，提高蛋白合成水平，恢復(fù)自噬功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，針對IRE1α核酸內(nèi)切酶活性的抑制劑，如4μ8c、MKC-3946、SFT-083010、色霉素A3和ATP-競爭性抑制劑如APY29、sunitinib，以及天然活性物質(zhì)如槲皮素、白藜蘆醇等，均可以通過調(diào)控IRE1α通路，調(diào)節(jié)ERS，發(fā)揮治療作用，體現(xiàn)出巨大的潛在臨床應(yīng)用價值[24]。直接調(diào)控ATF6表達(dá)或活性的化合物，目前還未見報道，但研究表明，Nucleobindin 1可以通過抑制SP1活性，阻止ATF6活化。大量抗氧化活性的天然產(chǎn)物，如黃酮類的堪非醇等，可以通過下調(diào)ATF6，保護(hù)機(jī)體免受ERS過度激活的損傷，具有很好的臨床應(yīng)用前景[25]。

綜上所述，ERS與自噬的持續(xù)性、破壞性交互作用是AD發(fā)生、發(fā)展的重要因素，針對這一病理過程進(jìn)行干預(yù)，對于緩解AD病程具有重要意義，因此成為治療AD極具應(yīng)用前景的藥物靶標(biāo)，為未來AD治療藥物的研發(fā)指明了重要方向。