付凌云， 楊 紅，林 丹，黃妮雯，徐旖旎，陶 玲，沈祥春

(貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 1. 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗室、2. 藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗室、3. 貴州省普通高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價重點(diǎn)實(shí)驗室、4. 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心，貴州 貴陽 550025)

國內(nèi)外研究表明，心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)的高發(fā)病率和高死亡率已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人們的身心健康，預(yù)計到2020年，將成為世界首要致死原因[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是CVDs的主要風(fēng)險因素，以血管內(nèi)膜形成纖維斑塊為特征，主要累及大動脈和中動脈，使動脈壁變硬，管腔狹窄，中膜彈性減弱。已經(jīng)證實(shí)AS是一種慢性炎癥疾病，炎癥是AS早期階段的關(guān)鍵事件，貫穿AS病理過程的始終[2]。

AS斑塊破裂是促進(jìn)AS發(fā)展的一個重要原因，炎癥誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生是AS斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)換為不穩(wěn)定的首要因素[3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最關(guān)鍵的血管新生促進(jìn)因子，在血管新生的過程中，它通過和自身的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮生物活性。VEGF受體-2(VEGFR-2)是VEGF發(fā)揮生物活性最關(guān)鍵的受體，故VEGFR-2的表達(dá)在血管新生相關(guān)信號通路中具有重要的作用[4]。研究表明，在心血管系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)重要的作用靶點(diǎn)，它能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2分泌增加，促進(jìn)血管新生，且該過程受到細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的調(diào)控[5]。

貴州地產(chǎn)民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith的干燥成熟果實(shí)，具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧之功效[6]。研究表明，艷山姜的主要活性成分艷山姜揮發(fā)油(essential oil of FructusAlpiniaezerumbet，EOFAZ)具有廣泛的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、防治心血管系統(tǒng)疾病等多方面的生物活性[7-9]。目前，國內(nèi)只有本實(shí)驗室在對EOFAZ進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗研究，但EOFAZ對TNF-α誘導(dǎo)的血管新生及炎性損傷的作用及機(jī)制還未明確。因此，本研究主要探討EOFAZ對TNF-α誘導(dǎo)的血管新生及炎性損傷的作用及機(jī)制，旨在為EOFAZ在預(yù)防和治療CVDs方面提供新的治療策略。

1 材料

1.1EOFAZ的提取和配制艷山姜的果實(shí)采集于貴州省貞豐縣，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德教授鑒定為姜科山姜屬植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith 的干燥成熟果實(shí)。水蒸氣蒸餾法提取，無水硫酸鈉除水后，于4 ℃長期保存。取50 μL(約為44.5 mg)EOFAZ于10 mL的EP管中，加入4 400 μL的二甲基亞砜完全溶解，即可得到濃度為1×107μg·L-1的EOFAZ母液，用1.5 mL的棕色EP管分裝于4 ℃冰箱保存。臨用時，用無血清培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。DMSO的終濃度不超過0.1%。

1.2實(shí)驗動物與細(xì)胞昆明種♂小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量(20 ± 2)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黔2018-0001)，使用許可證號：SYXK(黔2018-0001)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自美國ScienCell公司(批號：8000)。

1.3試劑內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國ScienCell公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；重組人/鼠TNF-α購自Peprotech公司；阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品檢定研究所(批號：100113-201405)；U0126購自Gene Operation Datasheet公司(批號：IMA1001-OO25MG)；VEGFR-2抗體和GAPDH抗體購自Proteintech公司；VEGFR-2和GAPDH引物購自貴陽金工科技有限公司；小鼠VEGFR-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4儀器3020-426多功能全波長酶標(biāo)儀(Thermo公司)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)、Universal Hood Ⅱ型實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)儀(Bio-Rad公司)；XDS-2B倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1動物模型的制備與分組60只昆明種小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：對照組、模型組(TNF-α 100 μg·kg-1)、單獨(dú)EOFAZ組(0.18 g·kg-1)、EOFAZ組(TNF-α+EOFAZ 0.18 g·kg-1)、阿司匹林組(TNF-α+阿司匹林200 mg·kg-1)，每組12只。對照組和模型組每日灌胃生理鹽水1次，單獨(dú)EOFAZ組和EOFAZ組每日灌胃EOFAZ 1次，陽性藥組每日灌胃阿司匹林1次，各組連續(xù)給藥7 d。各組末次給藥2 h后，除對照組和單獨(dú)EOFAZ組外，其余各組腹腔注射TNF-α建立小鼠急性炎癥損傷模型。干預(yù)24 h后，頸動脈插管取血，室溫3 500 r·min-1離心10 min收集血清，用于VEGFR-2酶聯(lián)免疫分析實(shí)驗，分離小鼠胸主動脈用于HE染色實(shí)驗。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組用含有5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、1%青霉素/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，將HUVECs接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2和95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行細(xì)胞換液和常規(guī)傳代培養(yǎng)，實(shí)驗所用細(xì)胞均為3～6代。選取生長良好的細(xì)胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)基同步化6 h后，先用EOFAZ、阿司匹林或U0126預(yù)處理1 h，再用TNF-α誘導(dǎo)24 h。實(shí)驗分為對照組、模型組(TNF-α 20 μg·L-1)、EOFAZ不同劑量組(TNF-α+EOFAZ 0.25、0.5、1.0 μg·L-1)、陽性藥組(TNF-α+阿司匹林0.25 mmol·L-1)、ERK抑制劑組(TNF-α+U0126 10 μmol·L-1)、EOFAZ不同劑量組與ERK抑制劑聯(lián)用組(TNF-α+EOFAZ 0.25、1.0 μg·L-1+U0126 10 μmol·L-1)。

2.3檢測指標(biāo)

2.3.1 HUVECs血管新生檢測 細(xì)胞按“2.2”分組給藥處理后，胰蛋白酶消化法制備成細(xì)胞懸液，以4×108·L-1的密度將細(xì)胞接種于包被了冷凍的基底膜基質(zhì)(10 g·L-1)的24孔板中。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37 ℃、5% CO2的條件下孵育6 h，小心將孔中培養(yǎng)基吸去，加入PBS洗3次，倒置顯微鏡采集照片，對小管成環(huán)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)5次。

2.3.2 Western blot檢測HUVECs中VEGFR-2蛋白表達(dá) 經(jīng)藥物干預(yù)后，每瓶細(xì)胞中加入適當(dāng)?shù)牧呀庖禾崛〉鞍?，用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度。將25 μg的蛋白在10% SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗(VEGFR-2為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶10 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，二抗(1 ∶7 000)孵育1 h。再次洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，然后將膜置于凝膠成像系統(tǒng)曝光，隨后用Image-Lab軟件對數(shù)字圖像進(jìn)行量化。實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3次。

2.3.3 Real-time PCR檢測HUVECs中VEGFR-2 mRNA表達(dá) 經(jīng)藥物干預(yù)后，根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA，然后將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后按照兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序95 ℃、30 s進(jìn)行預(yù)變性，95 ℃、5 s和62.5 ℃、30 s進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增，檢測VEGFR-2的基因表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用CFX-Manager軟件進(jìn)行統(tǒng)計。引物序列見Tab 1，實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3次。

2.3.4 小鼠胸主動脈HE染色分析 小鼠胸主動脈分離后，于10%中性福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色，光學(xué)正置顯微鏡下采集照片。

2.3.5 ELISA法檢測小鼠血清VEGFR-2水平 將經(jīng)過藥物干預(yù)的小鼠血清收集之后，根據(jù)試劑盒說明書操作。

Tab 1 Primer sequences of VEGFR-2 and GAPDH

3 結(jié)果

3.1EOFAZ和U0126對TNF-α誘導(dǎo)HUVECs中血管新生的影響病理性的血管新生是促進(jìn)AS斑塊不穩(wěn)定的主要原因，ERK信號通路在血管新生中具有重要的調(diào)控作用[8]。通過體外血管新生實(shí)驗，檢測EOFAZ和ERK抑制劑U0126對TNF-α誘導(dǎo)HUVECs血管新生的影響。如Fig 1所示，與對照組相比，TNF-α干預(yù)細(xì)胞后，HUVECs血管新生小管成環(huán)數(shù)量明顯增加，而給予EOFAZ和U0126預(yù)處理后，能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs血管新生小管成環(huán)的數(shù)量(P<0.01)。

3.2EOFAZ下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達(dá)VEGFR-2是血管新生中一個重要的調(diào)控分子[10]。如Fig 2所示，與對照組相比，TNF-α能夠上調(diào)HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達(dá)，而EOFAZ預(yù)處理能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達(dá)。

3.3EOFAZ下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)小鼠血清中VEGFR-2的水平動物實(shí)驗進(jìn)一步分析EOFAZ對TNF-α誘導(dǎo)小鼠血清中VEGFR-2分泌水平的影響。如Fig 3所示，與對照組相比，單獨(dú)給予EOFAZ時，對VEGFR-2的分泌水平?jīng)]有影響，差異無顯著性。提示EOFAZ本身對小鼠VEGFR-2的分泌水平?jīng)]有影響。而TNF-α干預(yù)后，小鼠血清中VEGFR-2的水平明顯升高，EOFAZ預(yù)處理能下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)小鼠血清中VEGFR-2的水平，差異具有顯著性(P<0.05)。以上結(jié)果提示，EOFAZ可能通過下調(diào)VEGFR-2的表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs血管新生。

3.4EOFAZ通過VEGFR-2-ERK信號通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs血管新生研究表明，VEGFR-2-ERK信號通路在血管新生中具有極為重要的作用[4]，為了進(jìn)一步研究EOFAZ抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs血管新生的作用機(jī)制，采用EOFAZ和ERK抑制劑U0126聯(lián)用處理HUVECs。如Fig 4所示，與TNF-α組相比，ERK抑制劑U0126能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs中VEGFR-2蛋白和mRNA的表達(dá)，提示ERK信號通路能夠調(diào)控VEGFR-2的表達(dá)。

Fig 1 EOFAZ and U0126 inhibited number of tube formation in TNF-α-induced HUVECs n=5)

A: The tube formation figures (×50). a: Control group; b: TNF-α group (20 μg·L-1); c: EOFAZ group (1.0 μg·L-1); d: EOFAZ group (0.5 μg·L-1); e: EOFAZ group (0.25 μg·L-1); f: Aspirin group (0.25 mmol·L-1); g:U0126 group (10 μmol·L-1) ; B: The tube formation statistical figure.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

Fig 2 EOFAZ inhibited protein expression of VEGFR-2 in TNF-α-induced HUVECs n=3)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

Fig 3 EOFAZ down-regulated expression of VEGFR-2 in serum of TNF-α-induced mice n=12)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

單獨(dú)的U0126干預(yù)組和EOFAZ與U0126聯(lián)用干預(yù)組都能抑制VEGFR-2蛋白和mRNA表達(dá)，但差異無顯著性，提示EOFAZ可能是通過ERK通路，下調(diào)VEGFR-2的表達(dá)。

3.5EOFAZ抑制TNF-α誘導(dǎo)小鼠胸主動脈中炎性細(xì)胞浸潤動物實(shí)驗研究EOFAZ對TNF-α誘導(dǎo)小鼠胸主動脈炎性損傷的作用。如Fig 5所示，對照組中小鼠胸主動脈外膜、中膜及內(nèi)膜均未見炎性細(xì)胞浸潤；TNF-α干預(yù)后，可見小鼠胸主動脈外膜和中膜有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(圖中紅色箭頭所指處)，而給予EOFAZ預(yù)處理可明顯抑制小鼠胸主動脈中炎性細(xì)胞的浸潤。

Fig 4 Combination of EOFAZ and U0126 down-regulated protein and mRNA expressions of VEGFR-2 in TNF-α-induced HUVECs

A: The protein expression of VEGFR-2; B: The mRNA expression of VEGFR-2.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group.

4 討論

血管新生是AS重要的病理學(xué)特征，在AS易損斑塊中發(fā)現(xiàn)有大量的血管新生，血管新生對維持AS斑塊的穩(wěn)定性具有重要的作用[10]。VEGFR-2是VEGF的高親和性受體，是調(diào)控血管新生的重要分子。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGFR-2也有表達(dá)，本研究通過體外培養(yǎng)HUVECs，采用血管新生實(shí)驗，觀察TNF-α對HUVECs血管新生的影響，并應(yīng)用EOFAZ對上述過程進(jìn)行干預(yù)。

Fig5EOFAZinhibitedinflammatorycellsinfiltrationinthoracicaortaofTNF-α-inducedmice(×400)

A: Control group; B: TNF- α group (100 μg·kg-1); C: EOFAZ group (0.18 g·kg-1); D: EOFAZ 0.18 g·kg-1+ TNF-α 100 μg·kg-1; E: Aspirin 200 mg·kg-1+ TNF-α 100 μg·kg-1.當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α等炎性細(xì)胞因子刺激時，會使細(xì)胞內(nèi)VEGFR-2的表達(dá)上調(diào)，參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生，加快AS進(jìn)程[11-12]。因此，抑制炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管新生，已經(jīng)成為延緩AS斑塊破裂的重要治療靶點(diǎn)。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠誘導(dǎo)HUVECs大量血管新生，可見小管成環(huán)數(shù)量明顯增多，而EOFAZ干預(yù)后，HUVECs小管成環(huán)數(shù)量明顯降低。同時，Western blot和動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠上調(diào)HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達(dá)及小鼠血清中VEGFR-2的水平，EOFAZ干預(yù)后，能夠明顯下調(diào)HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達(dá)及小鼠血清中VEGFR-2的水平。提示EOFAZ對TNF-α誘導(dǎo)HUVECs血管新生的抑制作用可能與下調(diào)VEGFR-2表達(dá)有關(guān)。

ERK是絲裂原激活蛋白激酶家族中的主要成員之一，主要參與細(xì)胞的增殖過程。研究表明，TNF-α等炎性細(xì)胞因子刺激，能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞中的ERK信號，從而對內(nèi)皮細(xì)胞血管新生及VEGFR-2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[13]。我們采用ERK抑制劑U0126對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究EOFAZ抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs血管新生及VEGFR-2表達(dá)的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U0126能夠明顯抑制HUVECs血管新生小管成環(huán)數(shù)量及VEGFR-2的表達(dá)。更重要的是，在Western blot和qRT-PCR實(shí)驗中，單獨(dú)U0126干預(yù)組和U0126與EOFAZ聯(lián)用干預(yù)組都能夠明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs中VEGFR-2蛋白和mRNA的表達(dá)，但差異無顯著性，提示EOFAZ下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)HUVECs中 VEGFR-2的表達(dá)可能與ERK信號通路有關(guān)。

本研究還通過TNF-α干預(yù)小鼠，觀察EOFAZ對TNF-α誘導(dǎo)小鼠炎性損傷的影響。結(jié)果表明，TNF-α干預(yù)后，增加了小鼠胸主動脈外膜和中膜炎性細(xì)胞的浸潤，說明我們建立的炎性損傷模型是成功的。而給予EOFAZ干預(yù)后，能夠明顯抑制炎性細(xì)胞的浸潤，提示EOFAZ能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的小鼠炎性損傷。

綜上所述，EOFAZ能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs中血管新生及小鼠炎性損傷，其機(jī)制可能與通過ERK信號通路抑制VEGFR-2的表達(dá)有關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗于貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗室完成，感謝實(shí)驗室各位老師的悉心指導(dǎo)以及同學(xué)的幫助！)