胡杭琦，薛文達(dá)，闞明韻，王 薇

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究中心中醫(yī)腦病重點實驗室、2. 第一臨床醫(yī)學(xué)院、3. 心理學(xué)院，江蘇 南京 210023；4. 南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南通 226001)

越鞠甘麥大棗湯在中醫(yī)治療郁證的臨床運用中取得了很好的療效，且毒副作用小[1]。前期實驗發(fā)現(xiàn)，越鞠甘麥大棗湯能夠快速修復(fù)抑郁小鼠的失樂狀態(tài)[2]，其作用機制可能與上調(diào)Akt/mTOR信號通路，提高突觸可塑性，以及促進神經(jīng)元再生有關(guān)[3]。本研究擬采用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22氧化損傷模型[4-5]，探究越鞠甘麥大棗湯的保護作用，有助于指導(dǎo)該方的臨床應(yīng)用。

1 材料

1.1實驗動物7 ～ 8周齡ICR小鼠，♂，體質(zhì)量20～22 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK(蘇)2014-0002。

1.2藥物實驗用中藥材均購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診。越鞠甘麥大棗湯由蒼術(shù)100 g、香附100 g、神曲100 g、梔子100 g、川芎100 g、炙甘草125 g、淮小麥250 g、大棗375 g組成，上述藥物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h后過濾，再加6倍量水，按上法煎煮后過濾，合并兩次藥液，于65 ℃減壓旋蒸濃縮，濃縮后的藥物濃度為8.3 g·kg-1。

Tab 1 Effects of different concentrations of Yueju Ganmai Dazao decoction serum on survival rate, LDH leakage rate, SOD and MDA of impaired HT22 cells induced by n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

1.3試劑DMEM培養(yǎng)液(HyClone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；胰酶細(xì)胞消化液(含酚紅)(碧云天公司)；MTT(Solarbio公司)；H2O2(致遠(yuǎn)化學(xué)制劑有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒，均購于南京金益柏生物科技公司。

2 方法

2.1越鞠甘麥大棗湯含藥血清的制備小鼠按10 mL·kg-1的劑量灌胃給藥，每日2次，連續(xù)3 d，最后1次灌胃后1 h眼球采血，分離血清，于56 ℃、30 min滅活后過濾除菌，備用。

2.2MTT法檢測HT22細(xì)胞的存活率細(xì)胞呈對數(shù)生長期時，以 6×107·L-1的密度接種培養(yǎng)，18 h后加入H2O2(400、600、800、1 000 μmol·L-1)，處理1 h后，加20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，492 nm處檢測OD值。給藥組在H2O2造模后，給予越鞠甘麥大棗湯血清(1%、5%、10%)，作用24 h后，檢測細(xì)胞存活率。預(yù)給藥組加入不同濃度越鞠甘麥大棗湯血清(1%、5%、10%、20%)預(yù)處理24 h，再用H2O2造模1 h后，檢測細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(造模組A值-調(diào)零組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)×100%

2.3ELISA法測定LDH、MDA、SOD濃度取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞樣品，按試劑盒說明書操作，分別測定LDH、MDA和SOD濃度。

3 結(jié)果

3.1不同濃度H2O2對HT22細(xì)胞存活率的影響不同濃度的H2O2均可明顯降低HT22細(xì)胞的存活率(P<0.01)。并以600 μmol·L-1(細(xì)胞存活率49%)作為后續(xù)H2O2造模濃度。

3.2越鞠甘麥大棗湯血清對H2O2損傷的HT22細(xì)胞存活率的影響造模后，細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，5%和10%越鞠甘麥大棗湯血清給藥可以明顯提高細(xì)胞存活率(P<0.01，P<0.05)，見Tab 1。

3.3越鞠甘麥大棗湯血清對H2O2損傷的HT22細(xì)胞LDH、SOD、MDA的影響Tab 1結(jié)果顯示，造模后能明顯增加LDH相對漏出量(P<0.05)，1%、5%、10%越鞠甘麥大棗湯血清給藥均能明顯降低LDH相對漏出量(P<0.01)，且5%給藥濃度效果最好。造模后SOD活性明顯降低(P<0.01)，5%越鞠甘麥大棗湯血清給藥可明顯增強SOD活性(P<0.01)。造模后MDA含量明顯提高(P<0.05)，5%越鞠甘麥大棗湯血清給藥能明顯降低MDA含量(P<0.05)。

3.4預(yù)防性給予越鞠甘麥大棗湯血清對H2O2損傷的HT22細(xì)胞存活率的影響造模組與越鞠甘麥大棗湯血清預(yù)給藥組的細(xì)胞存活率均明顯下降(P<0.01)，但造模組與預(yù)給藥組之間差異無顯著性(Tab 1)。

4 討論

本研究觀察了越鞠甘麥大棗湯對于小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22氧化損傷的修復(fù)作用，結(jié)果證實，越鞠甘麥大棗湯可以降低胞內(nèi)LDH漏出率和MDA含量，提高SOD活性，而這種作用不具有預(yù)防性，提示其修復(fù)作用可能與提高抗氧化能力、抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，而其內(nèi)在機制有待進一步研究。