邵采鳳，張雯瑋，胡朝婷，王冉超，接 玉，趙昶昀，陳 茜，楊 鯤

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002; 3. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院2015年級本科生，江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 4. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院2016年級本科生，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì) (periaqueductal gray, PAG) 在傷害性信息的下行抑制系統(tǒng)中處于至關(guān)重要的位置[1]。PAG的腹外側(cè) (ventrolateral PAG, vlPAG) 亞區(qū)是參與傷害性信息調(diào)制的重要區(qū)域。PAG發(fā)出的纖維終止于脊髓背角，參與脊髓水平傷害性信息的調(diào)制，PAG的研究重點集中在其vlPAG亞區(qū)[1-2]。

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 是PAG內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2]。GABA能突觸分泌的GABA與突觸后GABA受體結(jié)合，后者包括GABAA受體和GABAB受體[1]。同時，谷氨酸是最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸能突觸分泌的谷氨酸與突觸后谷氨酸受體結(jié)合，后者包括NMDA受體[3]和AMPA受體。由于GABAB受體既表達(dá)在谷氨酸能突觸終末，也表達(dá)于GABA能突觸終末上，因此，從理論上推斷，GABAB受體激動劑可以激活這些受體，并抑制GABA能及谷氨酸能突觸[4-6]，繼而抑制GABA和谷氨酸的釋放。前期的實驗結(jié)果也印證了這個推斷[7-10]。

雖然GABAB受體被激活后，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)普遍引起“抑制效應(yīng)”，但是研究人員很早就注意到，不同濃度的GABAB受體激動劑在PAG發(fā)揮的作用不同，繼而通過影響下行抑制系統(tǒng)，產(chǎn)生“鎮(zhèn)痛”與“致痛”作用[2,11]。這些結(jié)果提示不同濃度的GABAB受體激動劑可能在PAG內(nèi)對興奮性突觸和抑制性突觸有影響，繼而打破動態(tài)平衡而影響PAG的輸出，最終造成對脊髓水平的傷害性信息調(diào)制的不同作用[7]。本實驗試圖用“飽和濃度”及“非飽和濃度”的GABAB受體激動劑巴氯芬分別激活PAG內(nèi)的谷氨酸能突觸及GABA能突觸，比較不同濃度的巴氯芬對上述兩類突觸的作用。根據(jù)已知的GABAB受體激動劑的藥代動力學(xué)特征，本實驗使用的“飽和濃度”和“非飽和濃度”的巴氯芬的濃度分別確定為5 μmol·L-1和 0.1 μmol·L-1[12]。最后，比較兩種濃度對單個PAG細(xì)胞興奮性的“凈作用”(net effects)，以探討不同濃度GABAB受體激動劑引起不同作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑巴氯芬和EGTA購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自中國上海國藥化學(xué)試劑公司。

溶液配制：① 人工腦脊液 (mmol·L-1，pH 7.2，滲透壓約305 mOsm): NaCl 124、KCl 2.6、CaCl22.5、NaH2PO41.2、MgCl21.2、NaHCO325、葡萄糖 11。② 腦薄片切片液 (mmol·L-1，pH 7.2):蔗糖 212.7、KCl 4、CaCl20.5、NaH2PO41.23、MgCl210、NaHCO326、葡萄糖10。③ 記錄電極內(nèi)液1(pH 7.2，由CsOH調(diào)節(jié), 滲透壓約290 mOsm)，記錄抑制性突觸后電流 (mmol·L-1): 甲基硫酸銫 85、CsCl 50、HEPES 10、MgCl22.5、Na2-ATP 4、Na3-GTP 0.4、Na-phosphocreatine 10、EGTA 0.6。④ 記錄電極內(nèi)液2(pH 7.2，由KOH調(diào)節(jié), 滲透壓約290 mOsm)，記錄興奮性突觸后電流 (mmol·L-1): K-gluconate 135、KCl 5、CaCl20.5、MgCl22、EGTA 5、HEPES 5、Mg-ATP 3.6。

1.2實驗動物6～8周齡 ♂ Sprague-Dawley (SD) 大鼠，購自江蘇大學(xué)實驗動物中心，實驗許可證號為SCXK (蘇) 2013-0011。本實驗有關(guān)使用動物的程序均經(jīng)江蘇大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合相關(guān)倫理規(guī)范。

1.3PAG腦片的制作PAG腦片的制作方法參見文獻(xiàn)[7-9]，異氟醚吸入將大鼠深度麻醉，于第2頸椎水平迅速斷頭；沿顱正中線剪開大鼠頭部皮膚，暴露顱骨，以尖嘴骨剪從椎孔向上沿顱骨矢狀縫向前剪開至雙眼連線位置，小心剝開切除顱骨，暴露鼠腦，以專用刮刀剝離全腦(包括大腦、中腦、小腦和部分腦干)。浸入用混合氣體(95% O2+5% CO2)充盈飽和的冰冷的人工腦脊液中；在解剖顯微鏡(江西上饒鳳凰光學(xué)儀器公司)下，仔細(xì)修剪大腦，用手術(shù)刀修去多余部分，得到1個包含中腦的腦塊；將腦塊輕貼附于瓊脂塊上，用速干膠將瓊脂塊黏于7000smz-2 振動切片機(jī)(英國Campden Instruments公司)載物臺上，橫切薄片厚度設(shè)定為350 μm，振動頻率為80 Hz，刀片前進(jìn)速度為0.1 mm·s-1；將橫切的包含PAG的中腦薄片放在約36 ℃的人工腦脊液中孵育30 min, 再轉(zhuǎn)移到室溫 22～24 ℃人工腦脊液中保存?zhèn)溆?。全程液體均由上述混合氣體充盈，以維持必要的酸堿度和氧氣濃度。

1.4全細(xì)胞記錄在室溫條件下，將1枚切片移至記錄槽中，維持人工腦脊液灌注，速率6～8 mL·min-1。低倍鏡下選取PAG薄片的腹外側(cè)部分，再將高倍鏡置于該區(qū)域，使用BX51WI相差顯微鏡(日本Olympus公司)配合紅外水浸鏡頭在明視野下采集圖像，并連接至監(jiān)視器，觀察神經(jīng)元，選取“健康飽滿”的PAG細(xì)胞準(zhǔn)備記錄。

P-97微電極拉制儀(美國Sutter Instrument公司)將玻璃毛坯拉制成尖端約1 μm的記錄電極，由電極后端充以電極內(nèi)液。從電極后端給予適當(dāng)大小正壓，防止尖端堵塞。電極尖端進(jìn)入液體后，電阻約為4～6 MΩ。使用微操縱器移動電極，使其尖端移動至選定的神經(jīng)元細(xì)胞膜表面，并形成“酒窩”后，釋放正壓，改為適當(dāng)負(fù)壓吸引細(xì)胞，形成“巨歐姆”封接(電阻>1 GΩ)，對電極內(nèi)施加連續(xù)的短暫負(fù)壓，使電極尖端吸住的細(xì)胞膜破裂，電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)部相接，建立“全細(xì)胞記錄模式”[9,13]。

在電壓鉗模式下，設(shè)置鉗制電壓為-70 mV。當(dāng)電極內(nèi)充以Cs+內(nèi)液(電極內(nèi)液1)，可記錄到抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic currents, IPSCs)；當(dāng)電極內(nèi)液為K+內(nèi)液(電極內(nèi)液2)，可記錄到興奮性突觸后電流 (excitatory postsynaptic currents, EPSCs) 。在電流鉗模式下，使用電極內(nèi)液2且鉗制電流保持在0 pA時，可以記錄到突觸前同心圓電極刺激引起的突觸后電位(postsynaptic potentials, PSPs)[13]。所有信號都通過Axopatch 200B微電極放大器放大，經(jīng)由Axon Digidata 1550數(shù)模轉(zhuǎn)換器(均購自美國Molecular Devices公司)轉(zhuǎn)換信號，濾波頻率為5 kHz，采樣頻率為10 kHz。通過在電腦上運行的pClamp 10.2記錄軟件(美國Molecular Devices公司)記錄，或用此軟件通過數(shù)模轉(zhuǎn)換器的數(shù)字輸出，再經(jīng)隔離器(Stimulus Isolator A395, 美國WPI公司)給予突觸前刺激。

2 結(jié)果

2.1 “非飽和濃度”的巴氯芬對GABA能突觸和谷氨酸能突觸的作用本部分所有實驗均在室溫下進(jìn)行，因此，本實驗結(jié)果反映的是室溫下GABAB受體的反應(yīng)。首先，我們觀察了“非飽和濃度”的GABAB受體激動劑巴氯芬對GABA能突觸和谷氨酸能突觸的作用。0.1 μmol·L-1的非飽和巴氯芬灌流后，可將同心圓電極刺激引起的興奮性突觸后電流 (evoked EPSCs, eEPSCs) 的幅度由對照組的(106±10)pA降低到(89±11)pA (n=11,P<0.01)。同樣濃度的巴氯芬將同心圓電極刺激引起的抑制性突觸后電流 (evoked IPSCs, eIPSCs) 的幅度由對照組的(142.4±20)pA降低到(103±5)pA (n=10,P<0.01)。即0.1 μmol·L-1的巴氯芬對興奮性突觸后電流eEPSCs的抑制率為(14±3)%，而對抑制性突觸后電流eIPSCs的抑制率為(26±4)%，兩個抑制比率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038),見Fig 1A、1B。提示低濃度巴氯芬抑制更多的抑制性突觸傳遞。

2.2 “飽和濃度”的巴氯芬對GABA能突觸和谷氨酸能突觸的作用其次，我們研究了5 μmol·L-1的“飽和濃度”巴氯芬的作用。將同心圓電極刺激引起的興奮性突觸后電流eEPSCs的幅度由對照組的(106±10)pA降低到(19±3)pA (n=11,P<0.01)。同樣濃度的巴氯芬將同心圓電極刺激引起的抑制性突觸后電流eIPSCs的幅度由對照組的(142±20)pA降低到(33±7)pA (n=10,P<0.01)。平均每個神經(jīng)元的實驗結(jié)果，5 μmol·L-1的巴氯芬對興奮性突觸后電流eEPSCs的抑制率為(80±3)%，對抑制性突觸后電流eIPSCs的抑制率為(83±3)%，兩個抑制比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。見Fig 1C。

2.3 “飽和濃度”及“非飽和濃度”的巴氯芬對單個PAG細(xì)胞興奮性的“凈作用” 上述實驗表明，0.1 μmol·L-1的巴氯芬對興奮性突觸和抑制性突觸有不同比例的抑制作用，結(jié)果提示，該濃度下的巴氯芬“凈作用”可能有興奮性增加或興奮性降低兩種。最后，為了闡明上述問題，我們研究了單個神經(jīng)元的興奮性。形成全細(xì)胞記錄模式后，對單個PAG神經(jīng)元進(jìn)行電流鉗制，通過記錄電極使得電流始終保持為0，此時可以記錄到刺激引起的突觸后電位PSPs[7]。如Fig 2所示，突觸前刺激電極給予適量的刺激強(qiáng)度可以記錄到突觸后電位PSPs，給予飽和濃度的巴氯芬(5 μmol·L-1)將動作PSPs的數(shù)值由(3.65±0.25)ms·mV降低到(1.53± 0.21)ms·mV (P<0.01)，巴氯芬洗脫后頻率恢復(fù)到對照組水平(3.53±0.32)ms·mV。而“非飽和濃度”的巴氯芬 (0.1 μmol·L-1) 將突觸后電位PSPs提高到(15.30±2.51)ms·mV，在多數(shù)神經(jīng)元還可能引起動作電位爆發(fā) (Fig 2A4)。

Fig 1 Non-saturated concentration and saturated concentration GABAB receptor agonist baclofen inhibited both eIPSCs and eEPSCs

Baclofen at 0.1 μmol·L-1depressed the amplitude of eIPSCs (A) and eEPSCs (B) and at the concentration of 5 μmol·L-1, the amplitudes were largely depressed. The dashed line indicated the peak amplitude of either eIPSCs or eEPSCs. The pooled data showed that at 5 μmol·L-1baclofen inhibited the amplitudes of eIPSCs and eEPSCs with the same ratio, while at 0.1 μmol·L-1, it depressed with different ratios (C).**P<0.01vseIPSCs.

凈作用表示為突觸后電位PSPs的AUC，AUC提高代表巴氯芬對突觸的影響增加，AUC降低代表對突觸的作用降低。以上結(jié)果提示，“非飽和濃度”的GABAB受體激動劑對PAG神經(jīng)元的興奮性具有提高作用 (Fig 2B)。

3 討論

GABA是PAG內(nèi)最重要的抑制性遞質(zhì)，GABAB受體也是重要的調(diào)節(jié)PAG在下行抑制系統(tǒng)功能的受體[1,5]，因為GABAB受體既能抑制興奮性突觸，從而降低PAG神經(jīng)元的興奮性，又能抑制抑制性突觸，從而增加神經(jīng)元的興奮性。因此，GABAB受體的作用十分復(fù)雜，而其對興奮性突觸和抑制性突觸的“凈作用”決定了GABAB受體對PAG輸出的調(diào)節(jié)狀態(tài)，即如果巴氯芬的凈作用是降低了PAG神經(jīng)元的興奮性，則降低了下行抑制系統(tǒng)的輸出；反之，如果其作用是增強(qiáng)了PAG神經(jīng)元的興奮性，則增強(qiáng)了下行抑制系統(tǒng)的輸出[7]。

Fig 2 Saturated and non-saturated GABAB receptor agonist baclofen showed different actions on excitability of PAG neuron

A: Presynaptic stimulation-induced PSPs AUC was depressed by saturated concentration of baclofen (5 μmol·L-1), but the excitability was elevated by non-saturated baclofen (0.1 μmol·L-1). Baclofen at 0.1 μmol·L-1increased PSPs and even in some cases action potential occurred (A4). B: Pooled data showed that 5 μmol·L-1baclofen depressed AUC, but this depression was recovered after washout, while 0.1 μmol·L-1baclofen increased AUC. Wash: washout.**P<0.01vscontrol.

這兩種結(jié)果都影響到自PAG起的下行抑制系統(tǒng)的環(huán)路[1-2]。因為PAG的投射有經(jīng)中縫系統(tǒng)的延髓吻段腹側(cè)部再向脊髓背角投射，也有直接終止于脊髓背角[1-2]。無論是PAG內(nèi)巴氯芬微量注射[11]，還是鞘內(nèi)給予巴氯芬[14]，都能影響實驗動物的痛行為學(xué)反應(yīng)，這些可能都是通過GABAB受體的抑制作用和脫抑制作用實現(xiàn)對痛反應(yīng)的調(diào)節(jié)。本實驗中，我們在突觸水平獲得的直接證據(jù)表明，低濃度的巴氯芬引起了神經(jīng)元的興奮作用，這個因素可能是PAG水平GABAB受體引起脊髓水平鎮(zhèn)痛效應(yīng)的基礎(chǔ)之一。因為GABA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有復(fù)雜的功能[4-5,15]，但巴氯芬在PAG內(nèi)的作用最終引起脊髓水平的傷害性信息調(diào)制結(jié)果的解釋，還需進(jìn)一步實驗驗證[7]。

值得強(qiáng)調(diào)的是，因為巴氯芬既能降低興奮性谷氨酸的釋放，降低突觸后神經(jīng)元的興奮性，同時也能降低GABA的釋放，繼而通過“去抑制”的方式增加興奮性，因此某濃度下的巴氯芬凈作用可能有興奮性增加或興奮性降低兩種。為了判斷“凈作用”是興奮或抑制，我們在不加谷氨酸受體抑制劑或GABAB受體抑制劑的條件下，記錄突觸后綜合電位PSPs。我們判斷凈作用的方式是以基線延長線為界，線上面積增加，表示興奮性增加；線下面積增加，則表示抑制性作用增加。因為興奮性和抑制性同一時間軸上可以相互抵消，且本實驗中主要面積分布在基線延長線以上，因此主要巴氯芬的凈作用是對興奮性的作用。此方法為電生理常用計算方法之一[7]。

需要指出的是，GABAB受體激動劑與受體的結(jié)合，與其他受體類似，也有溫度依賴性。本實驗是在離體薄片室溫進(jìn)行，其實際藥代動力學(xué)與體溫可能存在差別。因此，為了探討巴氯芬的作用，還需進(jìn)一步驗證其在生理溫度(約36 ℃)的作用[16]。另外，GABAB受體及阿片μ受體都是下行抑制系統(tǒng)里的與胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)的受體，激活它們可能產(chǎn)生復(fù)雜的抑制及脫抑制作用[7,16]。我們當(dāng)前的實驗結(jié)果和前人的部分結(jié)果類似，其最終機(jī)制可能與受體激動劑的濃度等相關(guān)。

(致謝：本實驗在江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室實驗室完成，感謝解剖教研室姜平教授、歐陽琦副教授的指導(dǎo)及楊鯤實驗室同仁的幫助。)