黃倩，鄭曉吉,*，史學偉，單春會，王順利

（1. 石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；2. 新疆唐庭霞露酒莊有限公司，新疆五家渠 831300）

現(xiàn)代葡萄酒的生產(chǎn)過程中，葡萄酒泥中的廢酵母是葡萄酒釀造時的主要副產(chǎn)物之一，在酵母發(fā)酵后葡萄酒泥通常直接排放至自然環(huán)境中，造成很大的生物資源浪費和生態(tài)環(huán)境污染。葡萄酒泥廢酵母中含有大量谷胱甘肽（Glutathione，GSH）[1]，若得以提取可保護環(huán)境且具有廣闊的商業(yè)前景。谷胱甘肽由L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸三個氨基酸經(jīng)肽鍵脫水縮合而成，含有大量的γ-谷氨?；蛶€基生物活性基團。GSH在多種氧化還原反應中作為一種還原劑存在，對部分外源性毒性物質(zhì)如有機磷、有機氯、農(nóng)藥等具有解毒作用，可用來治療肝臟等人體解毒性器臟的損傷，延緩中老年人的細胞衰老，增強免疫細胞的分裂和活性，從而增強特異性免疫等。故GSH在醫(yī)學藥學、食品設計開發(fā)和保存以及化妝品等領(lǐng)域的需求量不斷增加，具有廣闊的市場前景和經(jīng)濟效益[2]。

目前國內(nèi)外關(guān)于GSH的制備方法主要有：高壓均質(zhì)法、高壓脈沖電場法、研磨法、酶法、超聲波法等。高壓均質(zhì)法優(yōu)點是一次性處理量大、生產(chǎn)效率高、過程簡單方便，但破壁后提取的GSH雜質(zhì)含量太高，產(chǎn)品的純度過低無法達到工業(yè)生產(chǎn)的要求。高壓脈沖法能耗低、處理時間短、不會造成遺傳物質(zhì)變性，同時使得浸提液的純度高，但由于設備昂貴處理量小，不能大規(guī)模的應用到工廠生產(chǎn)中。化學方法是利用細胞壁和細胞膜的組成結(jié)構(gòu)使胞內(nèi)需要提取的成分溶出，但目前由于使用的試劑為不易處理的化學溶劑，對環(huán)境影響較大，且提取過程中分解細胞膜和細胞壁，導致提取物不單一，無法達到分離提純的目的。溶解法是利用某些有機溶劑對酵母細胞壁的成分具有溶解作用，可專一性浸提目的細胞內(nèi)的物質(zhì)，且提取效率高，對環(huán)境的影響較小。

故本試驗采取溶解法提取GSH，提取試劑為乙醇。乙醇能順利通過酵母細胞的線粒體內(nèi)膜、外膜以及細胞質(zhì)膜，且不會像其他化學試劑以破壞細胞壁的三層膜的前提通過細胞的三層膜[3]。通過研究發(fā)現(xiàn)，利用熱水法和乙醇法提取釀酒酵母中的GSH，乙醇提取法得到的GSH提取量最高。雖然乙醇提取法浸提時間較長，但離心時間得到縮短，雜質(zhì)含量較低，且GSH的損失也相對較少[4]。這樣不僅對GSH進行了純化，還節(jié)約了資源和能源。Xiong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，體積分數(shù)為25%的乙醇能達到對高密度釀酒發(fā)酵后的酵母細胞提取GSH的最大值，且最高提取率達到0.31%。李雙石等[6]發(fā)現(xiàn)，對葡萄酒泥廢酵母的最佳處理條件是提取溫度50 ℃、時間60 min、添加量10 mL時，能得到最多的GSH提取量。故本試驗在設計單因素實驗時，對其他變量取上述研究的最優(yōu)值，對單一變量進行定性研究。為葡萄酒廢酵母提取谷胱甘肽的生產(chǎn)提供優(yōu)化數(shù)據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料及試劑

葡萄酒廢酵母泥，新疆張裕天珠葡萄酒業(yè)有限公司；Tris試劑，Amresco公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）試劑，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器及設備

80目篩網(wǎng)：安平縣篩網(wǎng)絲網(wǎng)有限公司；J-26XP冷凍離心分離機：美國貝克曼庫爾特有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計：浙江賽德儀器；SHC A-C水浴恒溫振蕩器：蘇州威爾實驗用品有限公司；移液器：北京卓信偉業(yè)科技有限公司；電子天平：JCS001，天衡儀器制造廠；分析天平：JJ223BC，雙杰測試儀器廠；96孔酶標板：豐源器材有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒泥的處理

去離子水與葡萄酒泥混合體積比為1∶1，對混合液進行80目篩網(wǎng)篩分。取篩分液于離心機中，4000 r/min下離心分離20 min，取上清液用去離子水溶解后繼續(xù)離心分離，重復上述步驟，直至上清液澄清所得的沉淀為白色為止。收集沉淀，將沉淀物置于55 ℃鼓風干燥箱鼓風干燥至能磨粉處理，磨粉后保存于干燥陰暗條件下。

1.2.2 乙醇法提取

稱取酒泥廢酵母干粉1.00 g于燒杯中，加入10 mL體積分數(shù)為25%的乙醇溶液，于恒溫水浴鍋50 ℃水浴攪拌60 min，離心冷卻至室溫的浸提液，待浸提液冷卻至室溫，于3000 r/min離心分離10 min，得到上清液和酵母細胞沉淀，所得上清液即為GSH浸提液。

1.2.3 單因素試驗

依據(jù)預試驗結(jié)果，分別固定其他因素水平，考察料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL）、乙醇體積分數(shù)（15%、25%、35%、45%、55%）、浸提時間（20、40、60、80、100 min）和浸提溫度（30、40、50、60、70 ℃）等因素對谷胱甘肽提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗得到的結(jié)果，取3個相鄰的顯著點確定酒泥廢酵母谷胱甘肽提取優(yōu)化設計的試驗因素和水平，利用Design-Expert軟件對谷胱甘肽提取進行試驗方案的設計以及數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。

1.2.5 GSH含量的測定

GSH含量的測定采用DTNB法：利用DTNB和GSH反應生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，利用該物質(zhì)在pH8.0時在412 nm的波長有最大吸收峰，用分光光度計測樣液的吸收值，并對所測吸光值做函數(shù)圖得到標準曲線[7]。

浸提液中GSH含量的測定：用0.5 mL GSH浸提液代替GSH標準溶液，根據(jù)上述測定方法來測定乙醇葡萄酒泥谷胱甘肽浸提液的吸光值，利用谷胱甘肽標準品得到的標準曲線線性關(guān)系即可計算待測樣品中的谷胱甘肽含量。每個處理設3個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

浸提液中GSH的含量用DTNB法來測定，利用Origin Pro軟件分析數(shù)據(jù)得到GSH濃度C與吸光值A(chǔ)的回歸方程為A=0.8489C+0.0396（R2=0.0996）。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 料液比對酒泥廢酵母GSH提取量的影響

由圖1可知，隨著料液比的比值變大，酒泥廢酵母GSH乙醇提取量開始緩慢增加，1∶10 g/mL的料液比時谷胱甘肽的提取量達到峰值，隨后提取量開始緩慢降低。因為當乙醇的溶液用量不足或者很少時，酵母細胞細胞壁沒有充分的被乙醇溶解破碎，導致細胞的通透性太低使GSH無法從細胞中溶解出；GSH本身不穩(wěn)定極易氧化，而乙醇的量過多會促進GSH氧化，同時乙醇的添加量變多會導致酵母細胞膜上的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶暴露出來，將GSH降解[8]，使提取出的GSH在提取過程中被氧化，導致GSH提取量減少。由此確定料液比的量初步為1∶10 g/mL。

2.2.2 乙醇的體積分數(shù)對酒泥廢酵母GSH提取量的影響

乙醇作為有機溶劑能夠增強酵母細胞的細胞膜脂類物質(zhì)的流動性，可以提高細胞通透性，細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放可以大大的加強。由圖2得到，乙醇的體積分數(shù)大于35%時，GSH的提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增加越來越少，由于GSH是一種易溶于水和低濃度醇，微溶于醇的活性肽[9]，乙醇的體積分數(shù)過大時會導致酵母細胞的內(nèi)外滲透壓值很大，致使酵母細胞破裂使大量的其他胞內(nèi)物質(zhì)流出，影響谷胱甘肽的純度，而當乙醇的體積分數(shù)過少的時候，很多谷胱甘肽由于乙醇量過少無法提取出來，致使谷胱甘肽的提取量減少。因此乙醇的體積分數(shù)初步確定為35%。

2.2.3 浸提的時間對酒泥廢酵母GSH提取量的影響

在乙醇體積分數(shù)為35%，添加量為10 mL的前提下，設置不同的浸提時間來考察GSH的提取量。由圖3得到在20 min的抽提時間時，GSH的提取量較低，浸提時間為60 min時達到峰值，而在當時間達到100 min，GSH的提取量急劇下降。由于細胞內(nèi)包括GSH在內(nèi)的多種物質(zhì)容易于細胞后，胞外溶液濃度提高，胞內(nèi)溶液濃度降低，細胞內(nèi)外出現(xiàn)了較大的滲透壓差和濃度差，濃度差和滲透壓差使得高濃度一側(cè)的物質(zhì)流向低濃度一側(cè)，導致GSH的提取量很少，35%體積分數(shù)的乙醇是稀溶液，為了平衡細胞內(nèi)外的滲透壓，乙醇溶液不斷的進入細胞，一段時間后，擴散達到平衡時，浸提的時間就不再起作用。所以在40～80 min時，提取率與時間呈正相關(guān)，而在時間超過80 min后，因為GSH的不穩(wěn)定性導致它的提取量下降，另外一個原因可能是由于GSH是具有強氧化性的物質(zhì)，具有很強不穩(wěn)定性，在空氣中暴露的時間過長，導致GSH的含量下降[10]。

圖1 料液比對GSH提取量的影響Figure 1 Effect of ratio of material to liquid on GSH extraction

圖2 乙醇的體積分數(shù)對提取量的影響Figure 2 Effect of volume fraction of ethanol on extraction

2.2.4 浸提溫度對酒泥廢酵母GSH提取量的影響

在乙醇體積分數(shù)為35%，添加量為10 mL，浸提時間為60 min的前提下，考察了不同浸提溫度對GSH提取量的影響。由圖4得到，乙醇提取酒泥廢酵母GSH的量隨著浸提的溫度升高呈現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，在50 ℃時達到峰值。原因是浸提的溫度對GSH的穩(wěn)定性有很大的影響，GSH的氧化速度與溫度成負相關(guān)，高溫條件下會導致GSH氧化損失從而導致結(jié)果值出現(xiàn)誤差；但如果浸提的溫度過低，會使酵母細胞壁和細胞膜與乙醇的相互作用變?nèi)?，GSH不易從細胞膜細胞壁溶出[11]。故乙醇提取酒泥廢酵母的GSH浸提溫度初步確定為50 ℃。

圖3 浸提時間對GSH提取量的影響Figure 3 Effect of extraction time on GSH extraction

圖4 浸提溫度對GSH提取量的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on GSH extraction

2.3 優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應面試驗的模型設計

以上述單因素試驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，用谷胱甘肽的最終提取率為考察指標，有目的選擇出4個單因素當中提取率較高的3個水平進行考察探究，從而更靠近本試驗的目的，更有利于最佳提取率的得出。利用Design-Expert V10.0.4 軟件對谷胱甘肽提取進行試驗方案的設計和數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。得到表1、表2、表3、表4。

表1 響應面因素水平及編碼Table 1 Response surface factor level and coding

表2 響應面結(jié)果與分析Table 2 Response surface results and analysis

表3 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Regression equation coefficients and their significance test results

表4 模型驗證結(jié)果Table 4 Model verification results

運用Design Expert程序?qū)Ρ?的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，分析響應值比較顯著的各項單因素，可得料液比、乙醇體積分數(shù)、浸提時間、浸提溫度與GSH提取量間的二元多項回歸方程：

由表3可以得到，模型回歸顯著（p＜0.0001），可以看出方程的一次項、二次項的影響都是顯著的，模型的校正決定系數(shù)R2adj為0.9911，說明99.11%響應值的變化能通過此模型解釋，可以確定該模型的設計值與試驗值擬合較好，試驗誤差很小。其中影響因素料液比＞乙醇體積分數(shù)＞浸提時間＞浸提溫度。通過以上數(shù)據(jù)得分得到相應的數(shù)據(jù)，該試驗可以用于酒泥廢酵母谷胱甘肽的浸提工藝的理論預測。

對得到的回歸方程進行方差分析以及顯著性檢驗，結(jié)果如表4。從表4可知，模型預測值與實際得到的值吻合的很好，該回歸方程可以用來確定最佳提取工藝的條件。

2.3.2 響應面結(jié)果圖形分析

根據(jù)回歸方程做出的模型響應曲面及其等高線如圖5至圖7所示。

對任何雙因素交互影響谷胱甘肽提取率的效應可通過圖5、圖6、圖7進行分析。得到了影響程度的強弱排序為：料液比＞乙醇的體積分數(shù)＞時間＞溫度，這與模型設計得到的方差分析的結(jié)果一致，說明了模型的試驗結(jié)果具有很強的可靠性。通過模型得到的回歸方程，利用軟件對其進行求解，以GSH的含量為指標，得到谷胱甘肽提取的最佳提取條件為：在料液比1：10.15 g/mL、乙醇體積分數(shù)35.51%、時間58.39 min、浸提溫度48.90 ℃，能得到最大的谷胱甘肽的提取量為8.8213 mg/g。根據(jù)響應面設計得到的最優(yōu)條件，對葡萄酒泥廢酵母浸提，得到谷胱甘肽的提取量為8.8198 mg/g，與理論設計得到的值相比較，實際浸提得到的值與理論值相差很少，說明模型設計優(yōu)化方案有效。

3 結(jié)論

本試驗以葡萄酒泥廢酵母液為原料，以4個單因素的試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，通過響應面分析法確立了乙醇提取酒泥廢酵母中GSH的最佳提取工藝參數(shù)，并確保了提取谷胱甘肽最優(yōu)工藝參數(shù)的穩(wěn)妥性和可靠性。在料液比為1∶10.15 g/mL、乙醇的體積分數(shù)為35.51%、浸提時間為58.39 min、浸提溫度為48.90 ℃的條件下對谷胱甘肽進行浸提，谷胱甘肽的平均提取率可以達到8.8213 mg。此研究提高了谷胱甘肽的提取率，對從葡萄酒酒泥中提取谷胱甘肽提供了實驗基礎(chǔ)。

圖5 時間和溫度等高線圖及交互項因素響應面圖Figure 5 Time and temperature contour map and interaction factor response surface diagram

圖6 時間和乙醇體積分數(shù)等高線圖及交互項因素響應面圖Figure 6 Time and ethanol volume fraction contour map and interaction factor response surface diagram

圖7 料液比和濃度等高線圖及交互項因素響應面圖Figure 7 Material to liquid ratio and concentration contour map and interaction factor response surface diagram