王志法，殷 強(qiáng)，顧春虎

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）的發(fā)明使心臟直視手術(shù)成為可能，為手術(shù)者提供更加清晰的視野，使多種復(fù)雜先天性心臟病的治療成為可能，但心臟長時間的缺血和缺血后的再灌注損傷也極易誘發(fā)心臟手術(shù)患者發(fā)生嚴(yán)重的急性糖代謝紊亂，導(dǎo)致心肌細(xì)胞攝取和利用葡萄糖障礙，是CPB致機(jī)體損傷的核心機(jī)制之一，顯著影響預(yù)后，但具體分子機(jī)制不明。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝主要通路磷脂酰肌醇－3－羥激酶（phosphatidyl inositol 3－kinase，PI3K）通路顯著受抑，而對細(xì)胞能量調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用的腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated pro?tein kinase，AMPK）通路未受抑制，并且在胰島素強(qiáng)化治療后其表達(dá)、活性增加，同時糖代謝紊亂得以改善。因此，假設(shè)在CPB致PI3K通路受抑時，AMPK通路在細(xì)胞糖代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控AMPK表達(dá)可以有效控制CPB糖代謝紊亂。本研究在CPB動物離體模型干預(yù)AMPK通路，結(jié)合心肌特異性AMPK基因敲除小鼠，觀察心肌葡萄糖利用等指標(biāo)，在器官水平明確AMPK通路是CPB后機(jī)體調(diào)控糖代謝及胰島素強(qiáng)化治療中的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究將為防治CPB引發(fā)的糖代謝紊亂，降低CPB所致機(jī)體損傷，提供新的治療靶點和思路。

1 材料與方法

1．1 材料 雄性 C57BL／6 小鼠，4 月齡，平均（26．0±1．4）g，正常飲食，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；AMPKα2－／－小鼠，4 月齡，平均（25．4±1．3）g，正常飲食，購于美國JAX公司。Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)（美國Radnoti公司）；MP150壓力換能器（美國Biopac Systems公司）；AcqKnowledge生物信息采集系統(tǒng)（美國Biopac Systems公司）；恒溫水浴鍋（中國華利達(dá)公司）；顯微手術(shù)器械；外科實體雙目顯微鏡；Cannon相機(jī)（日本 Cannon公司）；AE－100電子分析天平（瑞士Mettler公司）；三苯基氯化四氮唑（美國 Sigma公司）；Krebs－Henseleit碳酸緩沖液（KHB）；肝素（比利時 輝瑞比利時公司）。

1．2 方法

1．2．1 實驗分組 C57BL／6 小鼠和 AMPKα2－／－小鼠各18只，隨機(jī)分為 3組（n＝6）；①對照（Control）組；②缺血／再灌注（ischemia reperfusion，I／R）組；③AICAR（AMPK 激活劑）加 I／R（AICAR＋I(xiàn)／R）組。Control組以K－H緩沖液持續(xù)恒壓灌注120 min；I／R組在平衡30 min后，全心缺血30 min，再灌注60 min；AICAR＋I(xiàn)／R 組在缺血前10 min給予含 AICAR的 K－H 緩沖液（0．1 mmol／L）灌流 10 min 后，全心缺血30 min，再灌注60 min。

1．2．2 Langendorff離體心臟灌流模型的制備 取小鼠稱重后，給小鼠腹腔注射肝素鈉（500 U／kg）使其肝素化后，脫頸處死，迅速摘取心臟，置于4℃預(yù)冷KH 灌流液（NaCl 118 mmol／L，KCl 4．7 mmol／L，Mg?SO41．2 mmol／L，KH2PO41．2 mmol／L，CaCl22．5 mmol／L，NaHCO325 mmol／L，Na－EDTA 0．5 mmol／L，葡萄糖 11 mmol／L，以 95%O2及 5%CO2混合氣體飽和，pH 為 7．35～7．40）中，經(jīng)主動脈插管懸掛于Langendorff灌流裝置上，以K－H緩沖液進(jìn)行恒溫（37℃）、恒壓（80 mm Hg）、恒流（4 ml／min）灌注灌流。通過左心房切口向左心室插入一個與傳感器相連的球囊，通過微量注射器向球囊內(nèi)注水以調(diào)節(jié)左室舒張末壓保持在 5～10 mm Hg（1 mm Hg＝0．133 kPa）。壓力傳感器連接至計算機(jī)，采用 Acq Knowl?edge 3．8．1信號采集系統(tǒng)記錄左室壓力變化。實驗開始前，用正常KH液平衡灌注15 min，在此期間如果心臟的冠脈流出液高于15 ml／min或出現(xiàn)心律失常，將從實驗中去除。

1．2．3 葡萄糖濃度檢測 收集各組在I／R灌注開始前后2 min的冠脈流出液，通過氧化酶法檢測心臟I／R前后的冠脈流出液中葡萄糖含量。通過檢測葡萄糖濃度來反映心肌葡萄糖攝取能力，以評價心肌組織對胰島素的敏感性。

1．2．4 TTC染色法測定心肌梗死面積 在實驗結(jié)束后，將20 g／L的伊文思藍(lán)顏料經(jīng)主動脈逆行灌注左心室腔，藍(lán)染區(qū)為正常灌注區(qū)。摘取心臟，沖洗染料，制備左心室切片（2 mm）。切片用含10 g／L 2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazoliumchloride，TTC）的磷酸鹽緩沖液染色 20 min。將染色切片的前后均拍照片，使用Image－Pro Plus圖像軟件計算伊文思藍(lán)染色區(qū)（藍(lán)色區(qū)域，非缺血區(qū)）、TTC染色［紅色區(qū)域，危險區(qū)面積（area at risk，AAR）］和梗死區(qū)［白色區(qū)域，梗死面積（infarct area，INF）］面積。心肌梗死面積用INF和AAR的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1．2．5 胱天蛋白酶－3（caspase－3）活性檢測 實驗結(jié)束后，稱取各組小鼠心肌組織10 mg勻漿，Brad?ford法檢測蛋白濃度。按Chemicon公司caspase－3活性檢測試劑盒操作，通過pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Brad?ford蛋白定量結(jié)果計算心肌組織單位重量蛋白的caspase－3活性。

1．2．6 乳酸脫氫酶及心肌肌鈣蛋白 I（cardiac tropo?nin I，cTnI）釋放的測定 肌酸激酶（creatine kinase，CK）及cTnI是細(xì)胞壞死的一個重要指標(biāo)。收集各組在I／R灌注開始前后2 min的冠脈流出液，按照Abnova公司提供的ELISA試劑盒的操作步驟依次加入檢測液，在450 nm處讀取吸光值，實驗結(jié)果采用國際單位IU／g來表示。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 I／R降低離體心肌葡萄糖攝取，預(yù)給予AICAR改善I／R后心肌葡萄糖攝取 與對照組相比，I／R后心肌葡萄糖攝取量下降（P＜0．05），但是預(yù)給予AMPK的激活劑AICAR，可以改善I／R后心肌對葡萄糖的攝?。≒＜0．05）。 與C57BL／6小鼠對照組相比，AMPKα2－／－小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下心肌葡萄糖攝取下降，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。但是在AMPKα2－／－小鼠，給予AMPK 的激活劑AICAR 并不能改善I／R引起的心肌葡萄糖攝取下降（P＞0．05）。說明I／R引起心肌胰島素抵抗，但是預(yù)給予AMPK的激活劑AICAR可以部分改善缺血再灌注引起的心肌胰島素抵抗，但是此心肌保護(hù)作用在AMPKα2－／－小鼠消失。 見圖 1。

2．2 給予AICAR對缺血再灌注后心肌有保護(hù)作用

在C57BL／6小鼠中，與 I／R 組相比，AICAR 能明顯降低I／R心臟的心肌損傷，表現(xiàn)為灌流液中CK和 cTnI含量降低（圖2A 和圖2B，P＜0．05）、心肌梗死面積減?。▓D2C，P＜0．05）及心肌細(xì)胞凋亡減少（圖 2D；均P＜0．05）。 但是，在 AMPKα2－／－小鼠中，與I／R組相比，給予AICAR并不能有效地改善I／R后心肌的損傷程度（P＞0．05）（圖 2），表明在AMPKα2－／－小鼠，AICAR 的心肌保護(hù)作用消失。

2．3 預(yù)給予AICAR對小鼠離體心臟收縮和舒張功能的影響 為了進(jìn)一步明確給予AMPK的激動劑AICAR所帶來的生物學(xué)作用，筆者采用心率壓力指數(shù)衡量 I／R后心臟功能（圖 3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在C57BL／6小鼠，預(yù)給予AICAR促進(jìn)I／R后心臟收縮舒張功能的恢復(fù)。但是，上述保護(hù)作用在AMPKα2－／－小鼠消失，再次表明激活 AMPK 改善 I／R后的心肌胰島素抵抗對心肌有保護(hù)作用。

3 討 論

隨著心血管外科技術(shù)成熟，心肌保護(hù)措施的提高及CPB裝置的改善，心血管外科手術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率以及術(shù)后的病死率已顯著下降。但患者在進(jìn)行CPB時卻必須承受長時間的心臟停止搏動和血液供應(yīng)，血液和CPB人工材料長時間、大面積接觸，非搏動性灌注，體溫大幅升降，控制性低血壓，血液嚴(yán)重稀釋，以及手術(shù)創(chuàng)傷、出血、藥物等刺激，這些均可引起機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)、I／R損傷、嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)，最終引起患者術(shù)后的心功能損傷，其中由心臟I／R引起的心肌胰島素抵抗，可能是導(dǎo)致心功能損傷，最終導(dǎo)致患者并發(fā)癥發(fā)生率和病死率增加的重要原因之一［1］。因此及時降低甚至糾正心肌胰島素抵抗可能對改善患者預(yù)后具有重要意義。

圖1 預(yù)給予AICAR改善I／R后心肌葡萄糖攝取

圖2 預(yù)給予AICAR對缺血再灌注心肌有保護(hù)作用

圖3 激活A(yù)MPK對小鼠離體心臟收縮和舒張功能的影響

研究證實激活A(yù)MPK，可通過促進(jìn)心肌葡萄糖運載體 4（glucose transporter 4，GLUT4）向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運增加心肌葡萄糖攝取和利用，改善心肌胰島素抵抗。因此通過給予AMPK的激動劑AICAR可能會改善CPB下的心肌胰島素抵抗，進(jìn)而改善患者預(yù)后。

胰島素抵抗是機(jī)體、組織以及細(xì)胞的一種病理生理狀態(tài)，導(dǎo)致胰島素靶組織對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取以及利用障礙；胰島素抵抗下的靶組織需要超常量的胰島素才能引起正常量反應(yīng)［2］。在CPB下的心臟手術(shù)，由于血液稀釋、非搏動性灌注、創(chuàng)傷、低壓、低溫以及麻醉等刺激均可引起機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血中游離脂肪酸、葡萄糖、乳酸和甘油濃度升高，這些激素的增加會抑制胰島素在外周組織細(xì)胞對胰島素受體、胰島素受體底物－1（In?sulin receptor substrate，IRS－1）以及細(xì)胞分裂活化蛋白激酶的磷酸化作用。同時也有研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重應(yīng)激增加的腎上腺皮質(zhì)激素也會間接升高血糖以及導(dǎo)致胰島素抵抗［3］。

有大量的研究已經(jīng)證實，心肌葡萄糖氧化生成ATP是最經(jīng)濟(jì)、最高效的供能方式［4］。同時在心衰患者中研究發(fā)現(xiàn)，心肌葡萄糖攝取和利用下降是導(dǎo)致心功能障礙的重要原因［5］。在糖尿病中也有研究證實，心肌葡萄糖攝取下降是導(dǎo)致糖尿病心肌病的重要原因［6］。因此，CPB后心肌葡萄糖攝取障礙可能會引起心肌能量的生成不足，引起心功能下降。心肌功能障礙是CPB后患者并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率的增加的重要原因［7］。因此，尋找改善CPB導(dǎo)致的急性心肌胰島素抵抗的措施可能會改善CPB后患者的預(yù)后。

但與糖尿病導(dǎo)致的慢性胰島素抵抗相比，由于對急性損傷了解的很少，如手術(shù)等導(dǎo)致的急性心肌胰島素抵抗，且創(chuàng)傷后急性心肌胰島素抵抗的機(jī)制比較復(fù)雜，可能有眾多的因素可以導(dǎo)致急性心肌胰島素抵抗。由CPB導(dǎo)致生成增加的應(yīng)激性激素和炎性因子可能是導(dǎo)致心肌胰島素抵抗的重要原因之一［8］。在以前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CPB后的胰高血糖素、生長激素等會對抗胰島素的作用導(dǎo)致外周的胰島素抵抗［9］。有研究發(fā)現(xiàn)心肌I／R損傷是導(dǎo)致心肌葡萄糖攝取障礙獨立危險因素，同時有研究已證明激活A(yù)MPK可以恢復(fù)胰島素抵抗心肌葡萄糖的攝取，改善心肌胰島素抵抗。最新一篇研究已經(jīng)證明，AMPK的一種小的激動劑AICAR可以降低離體心臟的I／R損傷。但激活A(yù)MPK是否是通過改善I／R引起的心肌胰島素抵抗，降低心肌損傷的還未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)給予AMPK的激動劑AICAR，可以明顯的增加離體心肌葡萄糖的攝取和利用，進(jìn)而改善離體心肌的胰島素抵抗，發(fā)揮心肌保護(hù)的重要作用。更為重要的是通過心率－壓力指數(shù)檢測，筆者驗證了激活A(yù)MPK可以明顯的改善離體心肌的心臟收縮舒張功能。