肖 鋒，徐光寰，顧春燕，邵建國，陳麗燕，孫 艷，肖靜文

1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院病理科，南通 226006 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院普通外科，上海 200433 3.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院消化內(nèi)科，南通 226006

目前，肺癌是全世界所有癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)是最常見的肺癌類型，其根據(jù)組織起源主要包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌。近年來，肺腺癌發(fā)病率明顯升高；盡管肺腺癌的治療取得了長足的進(jìn)步，但由于其生物學(xué)特性復(fù)雜、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，手術(shù)切除后肺腺癌患者的長期生存率仍然較低。因此，更深入地研究與肺腺癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的因子及分子機(jī)制對于肺腺癌的早期診斷、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的監(jiān)測，以及療效和預(yù)后的判斷具有重要意義。

精氨酸酶-2(arginase-2, Arg-2)是生物體新陳代謝過程中重要的催化酶，主要催化L-精氨酸水解成尿素和L-鳥氨酸。Arg-2在人類多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。本課題組前期研究顯示[1-2]，肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織中Arg-2異常表達(dá)，并且與HCC組織學(xué)分級、細(xì)胞增殖和凋亡等相關(guān)。本研究擬進(jìn)一步探討Arg-2在肺腺癌中的表達(dá)情況及臨床病理學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院2011年12月至2017年10月收集的病例資料完整的肺浸潤性腺癌手術(shù)切除標(biāo)本(包括癌及其癌旁組織)108例。浸潤性肺腺癌的診斷參考國際肺癌研究協(xié)會/美國胸科學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會國際肺腺癌多學(xué)科分類分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)：(1)高分化，以貼壁結(jié)構(gòu)為主；(2)中分化，包括乳頭狀、腺泡結(jié)構(gòu)為主和浸潤性黏液腺癌；(3)低分化，以實體和微乳頭狀結(jié)構(gòu)為主[4]。所有病例均經(jīng)過2位中級以上職稱的病理醫(yī)師復(fù)習(xí)診斷，并接受6個月～6年生存隨訪。另外，收集7例新鮮的肺腺癌組織標(biāo)本和1例正常肺組織標(biāo)本，正常肺組織為肺大皰手術(shù)切取的周圍肺組織；-80℃保存。本研究通過南通市第三人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 RT-PCR實驗 參照TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取新鮮組織中總RNA，紫外分光光度計測定D260及D280值，計算RNA總含量。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)使用說明進(jìn)行，將所合成的cDNA保存于-20℃以備用。Arg-2上游引物：5′-AAG CTG GCT TGA TGA AAA GGC-3′，下游引物：5′-GCG TGG ATT CAC TAT CAG GTT GT-3′，產(chǎn)物長度為119 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCA TTT GCA GTG GCA AAG-3′，下游引物：5′-CAC CCC ATT TGA TGT TAG TG-3′，產(chǎn)物長度為202 bp。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s，共30個循環(huán)；72℃ 8 min。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后用凝膠分析系統(tǒng)對目的條帶進(jìn)行半定量分析。

1.3 蛋白質(zhì)印跡實驗 將凍存的新鮮組織標(biāo)本取出稱取質(zhì)量，加入蛋白裂解液，冰浴勻漿。待組織完全打碎后，以12 000×g的相對離心力于4℃離心30 min，取上清液測定蛋白含量。對蛋白樣品行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進(jìn)行濕式電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜于室溫封閉2 h，分別加入兔抗人多克隆Arg-2和小鼠抗人單克隆β-actin一抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品)，室溫孵育1 h后，4℃過夜。TBST漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗。ECL發(fā)光，暗室中顯影，定影。

1.4 免疫組織化學(xué)實驗及結(jié)果判定 采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，具體步驟參照免疫組織化學(xué)試劑盒(上海基因科技有限公司)說明書進(jìn)行。手術(shù)標(biāo)本離體30 min內(nèi)行固定、常規(guī)組織學(xué)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋處理，4 μm厚切片。實驗設(shè)陽性和陰性對照。檸檬酸鹽高壓抗原修復(fù)后，加入一抗4℃孵育過夜，然后加入二抗室溫孵育2 h，DAB顯色。由2位中級以上病理醫(yī)師采用雙盲法評定染色結(jié)果。每張切片在400倍放大光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，計數(shù)1 000個癌細(xì)胞，計算染色細(xì)胞陽性率。采用半定量積分法對癌細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞陽性率進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度分為4個等級：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無著色為0分。染色細(xì)胞陽性率分為5個等級：81%～100%為4分，51%～80%為3分，11%～50%為2分，1%～10%為1分，無染色細(xì)胞為0分。將2組評分相乘所得值，分為2個等級：0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。對免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果行χ2檢驗，組間比較采用Spearman秩相關(guān)分析。對隨訪結(jié)果行單因素分析，總生存率分析用log-rank檢驗，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。應(yīng)用多因素Cox比例風(fēng)險模型評估對生存有明顯影響的獨(dú)立因素。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Arg-2在新鮮肺腺癌組織中高水平表達(dá) RT-PCR檢測1例正常肺組織和7例肺腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果(圖1A)顯示：在正常肺組織中，Arg-2 mRNA無表達(dá)；而在7例新鮮肺腺癌組織中，有6例(case1、2、3、5、6、7)Arg-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，對應(yīng)的癌旁肺組織中Arg-2 mRNA不表達(dá)或低表達(dá)，另外1例患者(case 4)的癌組織和癌旁組織中均不表達(dá)Arg-2 mRNA。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果(圖1B)顯示：Arg-2在蛋白水平的表達(dá)情況與mRNA水平基本一致。以上結(jié)果說明，Arg-2在癌旁肺組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在肺腺癌組織中表達(dá)水平明顯升高。

2.2 Arg-2在肺腺癌組織中表達(dá)率升高 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步檢測Arg-2在108例肺腺癌及其對應(yīng)癌旁肺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：Arg-2陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2)；在108例肺腺癌組織中，Arg-2蛋白低表達(dá)者74例，高表達(dá)者34例；而對應(yīng)的108例癌旁組織中Arg-2蛋白均低表達(dá)。因此，Arg-2在肺腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.000 1)。

圖1 RT-PCR(A)和蛋白質(zhì)印跡法(B)分別檢測1例正常肺組織、7例肺腺癌及相應(yīng)癌旁肺組織中Arg-2 mRNA和蛋白的表達(dá)

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測Arg-2在肺腺癌組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位(EnVision二步法)

A：Arg-2在肺腺癌組織中高表達(dá)；B,C：圖A的局部放大，B示Arg-2高表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，C示癌旁肺組織中不表達(dá)Arg-2；D：Arg-2在肺腺癌組織中低表達(dá)；E,F：圖D的局部放大，E示Arg-2低表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)示癌旁肺組織不表達(dá)Arg-2.Origiral magnification: ×100(A,D), ×400(B,C,E,F)

2.3 Arg-2表達(dá)與肺腺癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 結(jié)果(表1)顯示：Arg-2蛋白表達(dá)與肺腺癌的分化程度(P=0.000 6)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002 8)、TNM分期(P=0.021 5)以及Ki-67指數(shù)(P<0.000 1)正相關(guān)，而與肺腺癌患者的性別、年齡、吸煙狀態(tài)及腫瘤大小均無顯著相關(guān)。

表1 Arg-2表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性 n, N=108

2.4 Arg-2蛋白與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析 Kaplan-Meier生存曲線(圖3)顯示：Arg-2低表達(dá)組肺腺癌患者的中位生存時間為42個月，Arg-2高表達(dá)組肺腺癌患者的中位生存時間為17個月；log-rank檢驗結(jié)果顯示，Arg-2高表達(dá)組的總生存率明顯低于Arg-2低表達(dá)組，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.762,P=0.009)。進(jìn)一步應(yīng)用Cox比例風(fēng)險模型分析Arg-2高表達(dá)對肺腺癌患者生存的影響，結(jié)果(表2)顯示：Arg-2高表達(dá)組與低表達(dá)組的危害比(hazard ratio, HR)為0.492，95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)為0.241～1.004(P=0.051)，提示Arg-2高表達(dá)不是肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖3 Arg-2低表達(dá)與高表達(dá)組肺腺癌患者的生存曲線

表2 多因素Cox比例風(fēng)險模型分析肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素

SE：標(biāo)準(zhǔn)誤差；DF：自由度；HR：危害比；CI：可信區(qū)間；Lower：下限；Upper：上限.*顯著相關(guān)

3 討 論

Arg-2是一種線粒體酶，基因定位于染色體14q24.1-24.3，廣泛分布于腦、乳腺、前列腺和腎臟等臟器[5-6]，其主要功能是促進(jìn)人體新陳代謝，并調(diào)節(jié)免疫功能等。有研究表明，Arg-2的異常表達(dá)與癌癥有著密切的關(guān)聯(lián)。Arg-2在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤組織中高水平表達(dá)[7-8]。本研究組之前的研究發(fā)現(xiàn)，Arg-2在HCC組織中也存在異常表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度與HCC的組織學(xué)分級正相關(guān)，提示Arg-2可能與HCC的生物學(xué)行為相關(guān)[1]。最近本研究組進(jìn)一步研究顯示，HCC組織中Arg-2表達(dá)與細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1表達(dá)正相關(guān)，提示Arg-2異常表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的增殖過程[2]。

本研究結(jié)果顯示Arg-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平在肺腺癌組織中明顯升高，而且Arg-2蛋白在肺腺癌組織中異常高表達(dá)與肺腺癌組織分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及增殖指數(shù)高正相關(guān)。因此，Arg-2高表達(dá)可能提示肺腺癌患者預(yù)后差。Costa等[9]研究也顯示，過表達(dá)Arg-2能夠促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶2/9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。以上2項研究結(jié)果均表明，Arg-2與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，Arg-2可能在其中發(fā)揮重要作用。由于納入本研究的少部分病例的隨訪時間較短，故本研究進(jìn)一步行多因素Cox比例風(fēng)險模型分析，結(jié)果顯示Arg-2高表達(dá)不是獨(dú)立的危險因素。本研究結(jié)果表明，Arg-2可能在肺腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，Arg-2高表達(dá)提示預(yù)后差，但不是獨(dú)立的預(yù)后因素。

分析Arg-2發(fā)揮生物學(xué)功能的作用機(jī)制，可能包括以下途徑：Arg-2通過催化精氨酸，合成精胺和亞精胺等，在促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮非常重要的功能[10-11]。Arg-2與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)均以精氨酸作為催化底物，Arg-2通過競爭性催化精氨酸，調(diào)節(jié)iNOS催化合成NO的量，從而影響NO發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤血管生成[12]、細(xì)胞毒性反應(yīng)及腫瘤免疫等生物學(xué)功能，最終調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡等生物學(xué)進(jìn)程。本研究組近期也報道，Arg-2與iNOS在HCC組織中的表達(dá)正相關(guān)，且與HCC微血管密度相關(guān)，提示Arg-2與iNOS可能參與調(diào)節(jié)HCC微血管的形成[13]。另外，Arg-2與淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫有關(guān)。Arg-2通過水解精氨酸，抑制T細(xì)胞增殖，最終影響機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫抑制功能[14-15]。McGovern等[16]的研究結(jié)果表明，在人胚胎發(fā)育過程中，Arg-2的活化能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，從而發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用；Arg-2還能夠激活骨髓源性抑制細(xì)胞，這種細(xì)胞由腫瘤誘導(dǎo)所產(chǎn)生，主要發(fā)揮免疫抑制作用，介導(dǎo)癌癥患者的系統(tǒng)性免疫功能障礙和局部的腫瘤免疫逃避[17]。總之，Arg-2可通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究明確了浸潤性肺腺癌組織中Arg-2的異常表達(dá)與組織分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及增殖指數(shù)高正相關(guān)，提示Arg-2可能參與調(diào)控肺腺癌的惡性生物學(xué)行為；同時Arg-2高表達(dá)提示患者預(yù)后差，但不是獨(dú)立的預(yù)后因素。進(jìn)一步探索Arg-2在肺腺癌組織中的作用機(jī)制將拓寬和深化人們對Arg-2功能的更全面的認(rèn)識，并對闡明肺腺癌的發(fā)病機(jī)制可能提供新的思路。