孫曉玲

(長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)分院，長春 130033)

生姜是姜科草本植物，是我國傳統(tǒng)常用調(diào)味料之一，具有散寒、健胃、驅(qū)風(fēng)、止吐等能效[1]。研究證明生姜中含有生姜油、姜辣素、黃酮和多糖類等生物活性成分，具有抗菌、抗氧化、降血脂等功能[2-5]。其中黃酮類化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物中，是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。 黃酮類化合物可改善血管的通透性，降低血脂和膽固醇，防治老年高血壓等，是人們?nèi)找娼邮艿囊环N天然活性成分。研究顯示生姜中的黃酮成分主要為雙羥黃酮，其提取液具有良好的抗氧化活性，對(duì)不同自由基具有良好的清除作用，能有效抑制油脂的氧化；生姜黃酮還具有一定的抑菌作用，對(duì)食品常見污染菌有一定的抑制作用[6，7]。目前應(yīng)用于提取生姜總黃酮的方法主要有浸提法、回流提取法和超聲提取法。上述提取方法主要利用不同高濃度的乙醇和甲醇，本文應(yīng)用纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮，考察了纖維素酶添加量、乙醇濃度、固液比等因素對(duì)黃酮提取率的影響，并通過優(yōu)化試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝，建立適合于生產(chǎn)應(yīng)用的生姜總黃酮的提取工藝，為其實(shí)際生產(chǎn)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜：市售；纖維素酶：信得利生物工程有限公司；蘆?。褐袊幤飞镏破窓z定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑：均為分析純。

KQ-500E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；722可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SC-3610 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.2 纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜黃酮

生姜樣品處理方法：生姜用清水沖洗干凈后，切成薄片，40 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎后過40目篩得提取實(shí)驗(yàn)樣品。

纖維素酶-乙醇提取方法：稱取生姜樣品1.00 g，加入適當(dāng)濃度乙醇溶液，置于水浴鍋內(nèi)加溫至設(shè)定溫度后，用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)整pH值，添加一定量的纖維素酶，保持恒溫酶解提取一定時(shí)間后，在沸水浴上滅酶10 min，經(jīng)4000 r/min速度離心10 min，取上清液備用。

1.3 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)中以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，選擇主要影響因素進(jìn)行考察，包括乙醇濃度、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、固液比6個(gè)因素。

選用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定需要進(jìn)行優(yōu)化的試驗(yàn)條件，從而確定纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的最佳工藝條件。

1.4 總黃酮測(cè)定方法

參考《保健食品功效成分檢測(cè)方法》測(cè)定樣品中總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，并以30%乙醇為溶劑，配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[8]。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.4 mL亞硝酸鈉溶液(5%)，靜置5 min后，加入0.4 mL硝酸鋁溶液(10%)，放置6 min后加入4 mL氫氧化鈉溶液(4%)，用30%乙醇定容后混勻，靜置10 min，在510 nm波長處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=10.12x-0.0032，mg/mL，相關(guān)系數(shù)r2=0.9989。

1.5 總黃酮提取率計(jì)算方法

生姜中黃酮含量的計(jì)算公式如下，以干燥后生姜樣品計(jì)算，單位為g/100 g。

式中：X為生姜樣品中黃酮的含量，g/100 g;m為生姜樣品的質(zhì)量，g；C為生姜提取液中的黃酮濃度，mg/mL；F為稀釋倍數(shù)。

1.6 超聲法提取生姜總黃酮

稱取樣品適量，以80%的乙醇為溶劑，按照料液比為1∶40(g/mL)加入溶劑，超聲波提取時(shí)間2 h，4000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定。

1.7 回流提取法

稱取樣品適量，以80%的乙醇水溶液為溶劑，固液比為1∶2，在80 ℃下回流3 h，4000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定。

1.8 生姜總黃酮清除羥自由基活性的測(cè)定

樣品測(cè)定液的制備：稱取姜粉10.00 g，按照不同方法的最優(yōu)提取工藝提取生姜總黃酮，濾液減壓濃縮回收乙醇后，真空干燥得提取物；以水為溶劑，制備濃度為25 μg/mL的待測(cè)液備用。

清除羥自由基活性的測(cè)定：取分別加入1.5 mL的2 mmol/L 硫酸亞鐵、30 mmol/L過氧化氫、6 mmol/L水楊酸，混合后將試管放入37 ℃水浴中，加熱15 min后取出，在λ=510 nm處測(cè)量其吸光度值A(chǔ)1；然后加入不同提取方法提取的生姜總黃酮溶液2.0 mL，混勻，置于37 ℃水浴加熱15 min，取出放置于室溫下，測(cè)其吸光度值A(chǔ)2。以蒸餾水作空白對(duì)照，以2 mL樣品液加4.5 mL蒸餾水作為參比并測(cè)其吸光度值A(chǔ)3，已消除樣品液中物質(zhì)對(duì)吸光值的干擾[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇濃度的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為0，10%，20%，30%，40%，50%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計(jì)為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h。同時(shí)做不同濃度乙醇生姜粉提取液的對(duì)照樣，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 The effects of ethanol volume fraction on the yields of total flavonoids

由圖1可知，與乙醇浸提法(對(duì)比法)相比，纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取姜粉總黃酮提取率高于對(duì)比方法，說明纖維素酶的加入更有利于原料基質(zhì)中黃酮成分的溶出，提高目標(biāo)成分的提取效率。分析圖1中曲線可知，當(dāng)乙醇濃度在0～30%之間時(shí)，姜粉總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而增加，酶解作用和乙醇浸提作用同時(shí)發(fā)揮，起到正向協(xié)同的作用；當(dāng)乙醇濃度增大到50%時(shí)，總黃酮提取率降低，與浸提法基本一致。推測(cè)是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖既芤簩?duì)酶活性有所抑制，影響酶解作用的發(fā)揮，乙醇浸提工藝發(fā)揮主導(dǎo)作用。因此在優(yōu)化試驗(yàn)中，乙醇濃度確定在25%～35%之間。

2.2 pH的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，分別調(diào)節(jié)pH到4.0，4.5，5.0，5.5，6.0后，按照干燥樣品粉末計(jì)為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 提取液pH值對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 The effects of pH value of extracting solution on the yields of total flavonoids

由圖2可知，在pH 4～6的范圍內(nèi)，姜粉總黃酮提取率波動(dòng)范圍不大，在0.50%～0.65%之間。當(dāng)pH為5.0時(shí)，姜粉總黃酮為0.65%，達(dá)到最大值；繼續(xù)增大pH，總黃酮提取率反而降低。這是因?yàn)閜H會(huì)影響纖維素酶的活性，而其活性又會(huì)影響酶解作用的發(fā)揮。纖維素酶的最適合酶解pH一般在4.5～6.0之間，在本試驗(yàn)的基質(zhì)體系中，最適pH為5.0。在后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中，確定反應(yīng)體系pH為5.0。

2.3 酶添加量的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計(jì)為0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 酶添加量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 The effects of enzyme dosage on the yields of total flavonoids

由圖3可知，反應(yīng)體系因?yàn)槔w維素酶的參與，總黃酮提取率增加，高于未添加纖維素酶的試驗(yàn)對(duì)照組。隨著酶添加量的增加，生姜總黃酮提取率增加到0.67%，但當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)到1%后，總黃酮提取率增長緩慢，酶添加量與姜粉質(zhì)量達(dá)到平衡，因此優(yōu)化試驗(yàn)中，酶添加量確定在0.5%～1.5%之間。

2.4 反應(yīng)溫度的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計(jì)為1.0%的添加量，加入纖維素酶，分別在30，40，50，60 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 The effects of extraction temperature on the yields of total flavonoids

由圖4可知，隨反應(yīng)體系溫度的升高，姜粉總黃酮提取率隨之增加。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，姜粉總黃酮提取率達(dá)到最高值0.64%。繼續(xù)提高溫度未能起到提高總黃酮提取率的作用，溫度低于50 ℃，不利于纖維素酶活性的發(fā)揮。因此在優(yōu)化試驗(yàn)中，確定酶解溫度為50 ℃。

2.5 固液比的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計(jì)為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 固液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 The effects of solid-liquid ratio on the yields of total flavonoids

由圖5可知，姜粉總黃酮提取率隨溶劑用量的增加而增加。增加溶劑用量可以增大基質(zhì)與溶劑的接觸面積，有利于總黃酮成分的浸出。當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時(shí)，總黃酮提取率增大幅度減慢，因此選擇固液比1∶20，1∶30和1∶40為優(yōu)化試驗(yàn)固液比的3個(gè)水平。

2.6 提取時(shí)間的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計(jì)為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下分別提取1，1.5，2，2.5，3 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6 The effects of extraction time on the yields of total flavonoids

由圖6可知，隨著提取時(shí)間的延長，姜粉總黃酮提取率不斷增加，給反應(yīng)體系目標(biāo)成分溶出足夠的時(shí)間。但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2 h后，總黃酮提取率明顯高于1 h時(shí)總黃酮提取率，并基本達(dá)到穩(wěn)定；繼續(xù)延長提取時(shí)間，總黃酮提取率增長緩慢，因此，確定2 h為最佳提取時(shí)間。

2.7 最優(yōu)提取條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定在優(yōu)化試驗(yàn)中選擇乙醇濃度、酶添加量和固液比為考察因素，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法采用L9(34) 正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其他提取參數(shù)分別為提取溫度50 ℃、提取時(shí)間2 h，pH5.5，正交試驗(yàn)因素、水平和結(jié)果分析見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 L9(34) 正交試驗(yàn)直觀分析表Table 1 Results of L9(34) orthogonal experiment intuitive analysis

續(xù) 表

由表1可知，影響生姜總黃酮提取率的主次因素為B>A>D，即酶添加量>乙醇濃度>固液比；確定總黃酮的最佳提取條件組合為A3B3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，酶添加量為1.5%，固液比為1∶40。

表2 正交試驗(yàn)方差分析表Table 2 Results of variance analysis of orthogonal experiment

由表2方差分析結(jié)果可知，在纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的優(yōu)化試驗(yàn)中，考察的3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無顯著性影響，主要是因?yàn)榭疾煲蛩厮皆O(shè)置的較接近最優(yōu)條件，梯度范圍較小的原因，從而使得因?yàn)橐蛩厮阶兓鸬寐什▌?dòng)范圍相對(duì)較小。

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，確定纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，pH值為5.0，酶添加量為1.5%，提取溫度為50 ℃，固液比為1∶40，提取時(shí)間為2 h。按照此條件重復(fù)進(jìn)行6次驗(yàn)證試驗(yàn)，可得姜粉總黃酮平均提取率為0.79%，RSD為0.431%。結(jié)果證明纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜粉總黃酮成分提取率高、提取效果穩(wěn)定。

2.8 3種提取方法的對(duì)比分析

分別采用纖維素酶-乙醇結(jié)合法、超聲提取法和回流法提取姜粉總黃酮，得總黃酮提取率分別為0.79%，0.72%，0.73%。由此可知3種提取法所得結(jié)果相近，提取率均高于0.7%。對(duì)比分析3種提取方法，纖維素酶-乙醇結(jié)合法和超聲提取法提取時(shí)間比回流提取法短1 h；對(duì)比超聲提取法，纖維素酶-乙醇結(jié)合法和回流法更易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；從能耗角度分析，纖維素酶-乙醇結(jié)合法和超聲提取法能耗較低。綜上分析可得應(yīng)用纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮具有提取率高、提取時(shí)長較合理、能耗低、適合工業(yè)化生產(chǎn)和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

2.9 羥自由基清除活性

選取羥自由基清除法測(cè)定生姜的抗氧化性質(zhì)，并對(duì)比分析3種提取方法生姜提取物和抗氧化劑Vc的羥自由基清除活性，結(jié)果見圖7。

圖7 不同提取方法生姜總黃酮提取率和羥自由基清除活性的對(duì)比Fig.7 Comparison of extraction rates and hydroxyl radical scavenging activities of flavonoids in ginger by different extraction methods

注：1為纖維素酶-乙醇結(jié)合法；2為超聲提取法；3為回流提取法。

由圖7可知，不同提取方法生姜總黃酮提取物對(duì)羥自由基清除能力的大小分別為纖維素酶-乙醇結(jié)合法>超聲法>Vc>回流法。由此可知，3種提取方法獲得的生姜提取物具有較好的羥自由基清除活性，其中纖維素酶-乙醇結(jié)合法和超聲提取法獲得的生姜提取物的羥自由基清除活性高于Vc，說明生姜提取物具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文選用纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮，發(fā)揮纖維素酶酶解樣品基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，結(jié)合乙醇的滲透和溶出作用實(shí)現(xiàn)生姜總黃酮的高效提取。利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)確定最優(yōu)提取條件。單因素實(shí)驗(yàn)中考察了纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度等6個(gè)主要影響因素對(duì)生姜粉總黃酮提取率的影響。在此基礎(chǔ)之上確定酶添加量、乙醇濃度和固液比為優(yōu)化試驗(yàn)中的考察因素，并確定了最優(yōu)提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，pH為5.0，酶添加量為1.5%，提取溫度為50℃，固液比為1∶40，提取時(shí)間為2h。在最優(yōu)條件下，纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的得率為0.79%，高于超聲提取法和回流提取法。纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮提取物的羥自由基清除活性也高于VC、超聲提取物和回流提取物。以上研究結(jié)果證明，纖維素酶-乙醇結(jié)合法可以較好地實(shí)現(xiàn)生姜總黃酮的高效提取，更好地保持其生物活性。