任汝靜，許瀞予，王 敏，柳辰玥，李曉強，尹 婷，杜成成，洪 坤，譚余慶，趙保勝△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 2. 廣東康力醫(yī)藥有限公司 廣州 510627；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

老年性癡呆是大腦皮質(zhì)功能衰退的一種臨床綜合征，患者主要表現(xiàn)為記憶衰退、行為認(rèn)知障礙[1]，其中最為常見的類型是阿爾茨海默癥(AD)，記憶障礙是AD病人的特征表現(xiàn)之一[2]。而尋找老年性癡呆明確的發(fā)病機制和有效的治療手段，是目前生物醫(yī)學(xué)界的一大研究熱點。本研究就康力康呆靈改善老年性癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并對其治療老年性癡呆進(jìn)行初步研究。

1 材料

1.1 實驗動物

早老型癡呆模型SAMP8雄性小鼠60只，體質(zhì)量28～35 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司(動物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2014-0004)。ICR雄性小鼠10只，體質(zhì)量28～32 g，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(動物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2016-0002)。

1.2 藥品與試劑

康力康呆靈，汕頭市壹杯通有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)許可證號QS440514010484)，將微粉加純凈水經(jīng)高剪切乳化機攪拌成均勻懸液4 ℃保存?zhèn)溆谩｛}酸多奈哌齊片(安理申)，中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司制造(批號1601044)；氯化鈉注射液(生理鹽水)，石家莊四藥有限公司生產(chǎn)(批號1508103203)；無水乙醇，北京化工廠生產(chǎn)(批號160318)；SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號20161216)；MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號20161216)。

1.3 儀器

鼠博士Morris水迷宮，上海移數(shù)信息科技有限公司生產(chǎn)；鼠博士跳臺儀及視頻分析系統(tǒng)，上海移數(shù)信息科技有限公司生產(chǎn)(版本V2.8.7)；FLUO star Omega全自動多功能酶標(biāo)儀，德國BMG LABTECH公司生產(chǎn)；SIGMA 1-15PK臺式高速離心機，德國sigma公司生產(chǎn)；電子體溫計，鄭州豪潤奇電子科技有限公司生產(chǎn)(專利號2009301940847)。

2 方法[3]

2.1 分組及給藥方法

SAMP8小鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組、康力康呆靈低劑量組(500 mg/kg)、中劑量組(1000 mg/kg)、高劑量組(2000 mg/kg)和陽性對照組(安理申55 mg/kg)各12只。10只ICR小鼠為正常對照組。

各實驗組小鼠均于每天上午8～10 時灌胃給藥，共灌胃4周。康力康呆靈組及陽性安理申組分別給予不同藥物，空白對照組每天同時給予等量純水灌胃，灌胃量0.2 ml/10 g。

2.2 實驗方法

2.2.1 康力康呆靈對小鼠水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響 水迷宮直徑120 cm，高30 cm，內(nèi)充自來水，水溫保持(23±2)℃。逃生平臺直徑14 cm，高29 cm，置于宮體內(nèi)坐標(biāo)位置的第三象限，低于水面0.7 cm。水迷宮試驗連續(xù)6 d，前4 d為訓(xùn)練時間。第5天將小鼠從同一位置放入水中，記錄小鼠的上臺潛伏期，上臺潛伏期超過60 s的記為60 s。計算出各組上臺百分比(即上臺動物數(shù)與動物總數(shù)之比)。第6天取出隱蔽平臺，將小鼠從同一位置放入水中60 s，記錄小鼠60 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)。

2.2.2 康力康呆靈對小鼠跳臺實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響 動物放置實驗儀內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境3 min，通交流電流0.25 mA，記錄每只小鼠從受到電擊到跳上跳臺的時間(逃避時間)和5 min內(nèi)從跳臺跳下的錯誤次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后將鼠放在跳臺上，記錄第1次跳下的時間(錯誤潛伏期)和3 min內(nèi)的錯誤次數(shù)，以此反映記憶保持情況。

2.2.3 康力康呆靈對小鼠避暗實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響 實驗裝置明暗兩室之間有一直徑3 cm的圓洞，暗室底部銅柵通電。訓(xùn)練前先將小鼠放入反應(yīng)箱中適應(yīng)5 min，然后暗室底部通以0.25 mA交流電，將小鼠背對洞口放入明室，每只小鼠訓(xùn)練5 min。記憶測試時將小鼠再次放入明室，記錄小鼠第1次進(jìn)入暗室的避暗潛伏期，并記錄5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯誤次數(shù)。

2.2.4 康力康呆靈對SAMP8小鼠SOD和MDA含量的影響 末次給藥后24 h，小鼠摘眼球取血并取小鼠腦組織，按照SOD、MDA測試試劑盒說明書測定血清與腦內(nèi)SOD、MDA含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 康力康呆靈對小鼠水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表1圖1～2顯示，給藥4周后，模型組小鼠上臺潛伏期明顯延長，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，康力康呆靈各劑量組上臺潛伏期均有所降低，低劑量組降低明顯(P<0.05)；康力康呆靈低劑量組上臺百分率較模型組明顯升高(P<0.05)；游泳軌跡結(jié)果顯示，康力康呆靈各劑量組小鼠的游泳軌跡均短于模型組小鼠，軌跡路線流暢，方向性明確，其中低劑量組最為明顯。撤掉平臺后，與模型組小鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，康力康呆靈低劑量組增加明顯(P<0.05)。游泳軌跡顯示，康力康呆靈各劑量組小鼠穿越平臺區(qū)域的軌跡和平臺所在象限的游泳軌跡均長于模型組，其中低劑量組最為明顯。

表1 康力康呆靈對SAMP8小鼠隱藏平臺實驗學(xué)習(xí)記憶能力比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05; 與模型組比較:▲P<0.05

3.2 康力康呆靈對小鼠跳臺實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響

給藥4周后，在學(xué)習(xí)階段與正常對照組比較，模型組小鼠上臺潛伏期明顯延長(P<0.01)。與模型組比較，康力康呆靈各劑量組上臺潛伏期均有所降低(P<0.01)，錯誤次數(shù)顯示，康力康呆靈低劑量組降低明顯(P<0.05)。

表2顯示，在記憶階段與模型組比較，康力康呆靈低、中劑量組與陽性藥安理申組逃避潛伏期有增長趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？盗荡綮`中、低劑量組與陽性藥安理申組的錯誤次數(shù)有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性組；D.康利康呆靈低劑量組；E.利康呆靈中劑量組；F.康利康呆靈高劑量組圖1 小鼠隱蔽平臺實驗游泳軌跡比較

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性組；D.康利康呆靈低劑量組；E.利康呆靈中劑量組；F.康利康呆靈高劑量組圖2 小鼠空間探索實驗游泳軌跡比較

組 別鼠數(shù)劑量/(mg/kg)學(xué)習(xí)階段記憶階段潛伏期/s錯誤次數(shù)/次錯誤潛伏期/s錯誤次數(shù)/次正常組10—2.90±1.520.50±0.71242.40±100.810.40±0.71模型組12—13.27±9.27**2.18±1.17**186.73±115.471.18±1.17陽性藥組12553.50±1.93▲▲0.58±0.51▲▲235.50±85.510.50±0.67低劑量組105002.81±1.33▲▲0.88±0.83▲191.00±105.170.75±0.71中劑量組810001.42±1.28▲▲1.17±1.17218.33±112.770.83±0.98高劑量組1020004.50±1.58▲▲1.90±1.37141.10±93.831.30±0.67

注：與正常對照組比較:**P<0.01; 與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 康力康呆靈對小鼠避暗實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響

給藥4周后，學(xué)習(xí)階段錯誤次數(shù)與模型組比較，康力康呆靈低劑量組小鼠錯誤次數(shù)下降明顯(P<0.05)。表3顯示，康力康呆各劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 康力康呆靈對SAMP8小鼠SOD和MDA含量的影響

表4顯示，末次給藥取材測試后，與模型組比較康力康呆靈各劑量組小鼠血清中SOD活力含量有增長趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；康力康呆靈中劑量組小鼠腦組織中SOD活力含量增長較為明顯(P<0.01)，低劑量和高劑量組與模型組比較有增長趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 康力康呆靈對SAMP8小鼠避暗實驗學(xué)習(xí)記憶能力比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05; 與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

表4 小鼠血清和腦組織中總SOD、MDA含量比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05；與模型組比較:▲P<0.05

與模型組比較，康力康呆靈各劑量組小鼠血清中MDA含量有所降低(P<0.01)；康力康呆靈低劑量組小鼠腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01)。

關(guān)于康力康呆靈各劑量組實驗?zāi)┢趧游餃p少的說明，在康力康呆靈改善學(xué)習(xí)記憶藥效學(xué)研究中，康力康呆靈各劑量組小鼠在給藥期間出現(xiàn)一定的皮損現(xiàn)象，且呈現(xiàn)一定的量-毒與時-毒關(guān)系，根據(jù)小鼠皮損現(xiàn)象出現(xiàn)的時間及給藥時長分析，初步推斷該現(xiàn)象與康力康呆靈給藥周期時長有關(guān)。

4 討論

隨著世界人口老齡化的加劇，老年性癡呆的發(fā)病概率也隨之上升，預(yù)計到2040年全球癡呆人數(shù)將達(dá)到8110萬，中國將達(dá)到2200萬，預(yù)計到2050年這一數(shù)字將上升到1.5億[4-5]。已知多種因素可造成老年性癡呆，其中人口學(xué)因素、行為因素、疾病因素為主。近年來的研究指出，社會心理因素也是誘發(fā)老年性癡呆的一個主要因素[6]。目前的研究認(rèn)為，老年性癡呆發(fā)病機制復(fù)雜，衰老自由基學(xué)說已得到公認(rèn)[7-8]，自由基引起的過年化損傷是老年性癡呆等疾病發(fā)病的一個重要原因。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可直接損傷生物大分子及細(xì)胞膜[9]，SOD是機體清除自由基的重要酶類，兩者直接參與體內(nèi)氧自由基代謝[10]。腦老化過程中，神經(jīng)細(xì)胞膜不飽和脂肪酸被氧化產(chǎn)生大量自由基，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，最終引起細(xì)胞凋亡、退行性病變、學(xué)習(xí)記憶能力下降[11-12]，最終導(dǎo)致老年性癡呆等眾多老年病的發(fā)生。因此抑制氧自由基生成，提供抗氧化功能及增加SOD等抗氧化酶類含量，成為目前研究的重點[14]。目前老年性癡呆的藥物治療首選是AchE抑制劑，同時根據(jù)具體情況聯(lián)合其他藥物使用以期達(dá)到保護(hù)腦神經(jīng)、恢復(fù)腦功能的治療效果，亦可聯(lián)合抗精神藥物治療行為癥狀和心理癥狀[1]。

康力康呆靈是由廣東康力醫(yī)藥有限公司開發(fā)的一款旨在改善神經(jīng)系統(tǒng)功能的保健產(chǎn)品，以茶為載體，以兔耳草為君藥，添加何首烏等中藥提取物，對抑郁癥、老年癡呆具有一定的改善作用。本實驗選用SAMP8早老性癡呆模型小鼠探究康力康呆靈對改善老年性癡呆引起的學(xué)習(xí)記憶能力下降和其簡單機制的研究。實驗結(jié)果表明，康力康呆靈不同劑量對小鼠的學(xué)習(xí)記憶力均有一定的改善作用，其中低劑量作用最明顯，康力康呆靈中、高劑量在提高學(xué)習(xí)能力方面作用較為顯著，在增強記憶能力方面作用不顯著?？盗荡綮`各劑量藥物可以在一定程度上改善小鼠氧化水平，降低氧化應(yīng)激損傷，其中低劑量作用最明顯。在研究中發(fā)現(xiàn)，康力康呆靈有效減少大鼠腦組織MDA含量的增加，而同時能夠提高大鼠腦組織的SOD活性。這些數(shù)據(jù)表明，康力康呆靈對AD大鼠腦組織氧自由基的清除具有明顯的改善作用，對老年性癡呆的防治具有一定作用。氧自由基在腦組織和血清中含量不同，但經(jīng)過藥物干預(yù)后顯示出對腦組織和血清不同的作用趨勢，在提高SOD含量方面，康力康呆靈可能在腦內(nèi)發(fā)揮更強作用，而在血清中顯示出更強的清除MDA能力。因此，通過本實驗結(jié)果認(rèn)為，康力康呆靈可能是通過影響模型小鼠氧化應(yīng)激途徑，減少MDA的產(chǎn)生，從而降低其對生物大分子及細(xì)胞膜的損傷作用。另一方面，康力康呆靈可提高SOD含量，使得氧自由基代謝加快，迅速減少由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA等有害物質(zhì)，減少對大腦的損害，達(dá)到改善老年癡呆的目的。大量臨床案例和動物實驗證實了中藥治療老年性癡呆的有效性。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下經(jīng)過合理組方，中藥對治療老年性癡呆有很大潛力。