劉 真，李 強(qiáng)，鄧博文，李承乘，李 杰，桑 鋒，王丹妮，徐立然

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心，河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000)

HIV感染人體需要病毒與靶細(xì)胞表面CD4受體及輔助受體相互作用，HIV-1病毒株進(jìn)入細(xì)胞的輔助受體主要為CCR5和CXCR4兩種[1]，目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T細(xì)胞表面CCR5和CXCR4的表達(dá)情況研究報(bào)道較多，但學(xué)者們并未取得統(tǒng)一性結(jié)論[2-3]。艾滋病病毒感染機(jī)體后會(huì)引起一系列的免疫反應(yīng)，研究已表明人類白細(xì)胞抗原(HLA)分子介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(CTL)對(duì)控制病毒的復(fù)制具有重要作用，白細(xì)胞分化抗原(CD38)和人類白細(xì)胞Ⅱ類抗原(HLA-DR)是反映細(xì)胞激活狀態(tài)的跨膜分子[4]。益艾康膠囊是治療艾滋病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，已在國(guó)家中醫(yī)藥管理局艾滋病救治項(xiàng)目(河南)中推廣使用。臨床研究表明，該制劑在臨床推廣中顯著提高艾滋病患者的免疫力[5-6]。我們?cè)谇捌诘难芯空撐闹袌?bào)道了我國(guó)HIV-1感染者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞表面激活分子CD38和HLA-DR表達(dá)水平升高[7]，而HIV感染后輔助受體表達(dá)與T細(xì)胞活化水平關(guān)系等方面的報(bào)道少見(jiàn)，尤其罕見(jiàn)中藥治療對(duì)細(xì)胞活化水平和輔助受體表達(dá)的研究。本研究分析了HIV感染者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞表面CD38和HLA-DR表達(dá)水平與輔助受體表達(dá)關(guān)系，探討益艾康治療對(duì)艾滋病病毒感染引起免疫損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

65例HIV-1陽(yáng)性標(biāo)本來(lái)源于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病門診收治的病人，均經(jīng)Elisa初篩和Western blot確診為HIV-1感染者，診斷均符合2011版本的《艾滋病診療指南》[8]。其中男34例，女31例，年齡16～45歲；健康對(duì)照人群10例，全部來(lái)自河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢者，與HIV感染人群在性別和年齡上均衡可比。65例感染者中11例未接受治療，其余54例為益艾康治療組。益艾康主要藥物組成：人參、黃芪、炒白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩等，具有健脾益氣、養(yǎng)血解毒的功效。服用方法為每日3次，每次5粒，療程6個(gè)月以上。所有樣品均在受試對(duì)象知情同意的情況下采集抗凝全血。

1.2 CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)

已標(biāo)記好的Trucount管中加入20 μL 抗- FITC-CD3、抗-PE-CD4、抗-PerCP-CD45、抗- APC-CD8混合抗體(BD公司)，后加入50 μL充分混勻的全血振蕩混勻，室溫避光20 min。然后加入450 μL 1 × FACS裂解液，立即振蕩混勻，室溫避光裂解10 min至溶液澄清。利用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用MultiSet軟件收集細(xì)胞并同時(shí)進(jìn)行分析，得到淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)及絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.3 血漿病毒載量測(cè)定

采用COBAS AMPLICOR HIV-1定量檢測(cè)試劑盒(Roche公司)在COBAS AMPLICOR全自動(dòng)PCR檢測(cè)儀上定量測(cè)定感染者血漿中HIV-1 RNA含量，病毒載量檢測(cè)下限為20 copies/ml。

1.4 CD8+T淋巴細(xì)胞表面輔助受體CCR5、CXCR4表達(dá)水平的測(cè)定

取100 μL EDTA抗凝新鮮外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、5 μL PE-CXCR4 Ab(BD)、5 μL APC-CCR5 Ab(BD)，混勻后室溫避光標(biāo)記20 min，然后加入2 ml溶血素，立即振蕩混勻，室溫避光10 min至溶液澄清，1500 r/min離心10 min，除去未結(jié)合的熒光抗體后洗滌細(xì)胞(2 ml PBS，1500 r/min離心10 min)，將染色好的細(xì)胞重懸于300 μL的PBS中，用BD CantoⅡ流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowjo軟件分析CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達(dá)水平。

1.5 CD8+T淋巴細(xì)胞表面CD38和HLA-DR表達(dá)水平的測(cè)定

取100 μL EDTA抗凝新鮮外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、10 μL PerCP-HLA-DR Ab(BD)、2.5 μL APC-CD38 Ab(BD)，混勻后室溫避光標(biāo)記15 min，加入2 ml溶血素立即振蕩混勻，室溫避光10 min至溶液澄清，1500 r/min離心10 min，除去未結(jié)合的熒光抗體，加入2 ml PBS溶液洗滌細(xì)胞，將標(biāo)記細(xì)胞重懸于300 μL的PBS中，用BD Calibur流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowjo軟件分析CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+百分比表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖采用Excel 2007、SPSS 16、GraphPad Prism 5完成，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較2組間病毒載量水平差異,多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)或Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T細(xì)胞表面輔助受體表達(dá)及細(xì)胞活化水平流式圖例

圖1、2顯示，利用多色流式細(xì)胞表面染色技術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面輔助受體(CXCR4/CCR5)及細(xì)胞活化水平(HLA-DR/CD38)，健康對(duì)照組、HIV未治療組、益艾康治療組3組典型流式圖例。

圖1 健康對(duì)照組、HIV未治療組、益艾康治療組CD8+T細(xì)胞表面輔助受體表達(dá)流式典型圖例

圖2 健康對(duì)照組、HIV未治療組、益艾康治療組CD8+T細(xì)胞活化水平流式典型圖例

2.2 HIV感染者輔助受體表達(dá)與T細(xì)胞活化水平相關(guān)性研究

圖3顯示，相較健康人群，HIV感染者CD8+T細(xì)胞表面CCR5表達(dá)升高，CXCR4表達(dá)降低。為探討輔助受體的表達(dá)是否與細(xì)胞活化水平相關(guān)，本研究分析了感染者體內(nèi)CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達(dá)水平與CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+的關(guān)系。結(jié)果顯示，CCR5+/CD8+表達(dá)與CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+成正相關(guān)，CXCR4+/CD8+表達(dá)與CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+成負(fù)相關(guān)。

2.3 益艾康治療對(duì)HIV感染者輔助受體和T細(xì)胞活化水平的影響

圖4表1顯示，為揭示益艾康對(duì)輔助受體及T細(xì)胞活化水平的影響，本研究比較分析了健康對(duì)照組、未治療組、益艾康治療組CD8+T細(xì)胞表面CCR5、CXCR4、CD38及HLA-DR表達(dá)水平，同時(shí)分析了不同組別間CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)和血漿病毒載量水平。結(jié)果顯示，未治療組和益艾康治療組CCR5、CD38及HLA-DR表達(dá)高于健康對(duì)照，健康人群CXCR4表達(dá)高于未治療組和益艾康治療組。健康對(duì)照組、未治療組、益艾康治療組CD4 count分別為711、402、476 cells/μL；3組CD38+/CD8+百分比分別為59.76%、80.33%、74.43%；HLA-DR+/CD8+百分比分別為47.51%、68.94%、61.07%；CCR5+/CD8+百分比分別為51.75%、59.41%、56.33%；CXCR4+/CD8+百分比分別為66.48%、43.54%、51.67%。CD4、CXCR4、CD38及HLA-DR的表達(dá)在3組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果顯示，益艾康治療組CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)和血漿病毒載量水平優(yōu)于未治療組，益艾康治療可部分恢復(fù)輔助受體的表達(dá)水平，相較未治療組益艾康治療可使T細(xì)胞活化水平接近于正常對(duì)照組。

3 討論

趨化因子是屬于細(xì)胞因子超家族的一類小分子物質(zhì)，主要由白細(xì)胞分泌通過(guò)與靶細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，主要功能是通過(guò)受體介導(dǎo)而引起粒細(xì)胞、單核/巨噬嗜細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的趨化作用遷移和活化，調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞的增殖，趨化因子及其受體在免疫反應(yīng)、器官發(fā)育、腫瘤形成等諸多病理及生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。趨化因子受體是一類表達(dá)于多種細(xì)胞表面且能與趨化因子結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白，是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體。自1981年美國(guó)首次報(bào)道艾滋病以來(lái)，人們不斷研究其發(fā)病機(jī)理、病程變化及防治方法，有關(guān)趨化因子及其受體與艾滋病的關(guān)系日益受到重視。HIV-1感染人體除通過(guò)結(jié)合T細(xì)胞表面的CD4分子外，還需與輔助受體相結(jié)合。與HIV感染密切相關(guān)的輔助受體主要為趨化因子受體CCR5和CXCR4[9-10]，由于輔助受體在HIV感染及致病過(guò)程中的關(guān)鍵作用，它們自然成為人們尋找防治艾滋病的重要突破口。

圖3 HIV-1感染者CCR5/CXCR4表達(dá)與CD8+T淋巴細(xì)胞活化水平(CD38、HLA-DR)的相關(guān)性

圖4 健康對(duì)照、HIV未治療組、益艾康治療組CD8+T細(xì)胞CCR5、CXCR4、CD38、HLA-DR表達(dá)比較

組 別例數(shù)CD4 count(cells/μL)LogVL(copies/ml)CD38+/CD8+ (%)HLA-DR+/CD8+ (%)CCR5+/CD8+ (%)CXCR4+/CD8+ (%)健康對(duì)照組10711±259▲/59.76±10.02▲47.51±17.92▲51.75±13.0966.48±11.62▲未治療組11402±286#4.26(4.08,4.66)80.33±6.37#68.94±10.36#59.41±9.8643.54±9.29#益艾康治療組54476±194#3.99(1.30,4.58)74.43±6.30#▲61.07±15.54#56.33±11.6351.67±10.86#▲F/t值—4.458-0.54625.7866.0320.2618.195P值—0.0270.587<0.0010.0040.7710.001

注： 與健康對(duì)照組比較:#P<0.05；與未治療組比較:▲P<0.05

免疫激活包括細(xì)胞活化、增殖、凋亡、細(xì)胞因子分泌等一系列過(guò)程，多種指標(biāo)均可用來(lái)反映免疫激活水平，CD38和HLA-DR表達(dá)常用來(lái)代表T細(xì)胞活化水平，研究表明HLA-DR和(或)CD38雙(單)陽(yáng)性的細(xì)胞比例對(duì)于HIV疾病進(jìn)展具有重要的預(yù)測(cè)作用[11-12]。本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，HIV感染者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞表面CD38和HLA-DR的表達(dá)比例顯著增高；CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)合CD8+T淋巴細(xì)胞的活化水平可以更全面地反映HIV感染者免疫功能受損的程度[7]。

益艾康膠囊主要藥物由人參、黃芪、炒白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩等組成，具有健脾益氣、養(yǎng)血解毒的功效，適合脾氣虧虛型HIV/AIDS患者的治療。經(jīng)過(guò)10余年的臨床應(yīng)用及國(guó)家“十一五”科技重大專項(xiàng)“無(wú)癥狀HIV感染者中醫(yī)藥早期干預(yù)研究”初步證實(shí)，益艾康膠囊具有改善HIV/AIDS患者臨床癥狀、體征，提高生存質(zhì)量，減少HIV/AIDS患者機(jī)會(huì)性感染發(fā)生頻次，穩(wěn)定或提高患者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，穩(wěn)定患者病毒載量，對(duì)部分患者病毒載量有一定的降低作用[5-6]。益艾康治療HIV的具體作用機(jī)制不明確。有研究表明，益艾康膠囊可在一定程度上降低HIV感染者體內(nèi)調(diào)控蛋白基因表達(dá)水平，升高Th1細(xì)胞百分比。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益艾康含藥血清能顯著促進(jìn)NK-92MI細(xì)胞增殖和細(xì)胞殺傷功能[13]?？共《警煼ㄔ诎滩』颊咧委熤兴霈F(xiàn)的不良反應(yīng)多、藥物價(jià)格昂貴、患者依從性差；相反，中藥不僅具有抗HIV病毒作用，還可提高人體免疫功能，其作用平和而持久、毒副作用小。因此，應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用中醫(yī)藥救治艾滋病患者已成為我國(guó)艾滋病防治工作的重要內(nèi)容。

HIV感染后CD4+、CD8+T細(xì)胞表面CCR5和CXCR4表達(dá)情況的研究報(bào)道較多，較為統(tǒng)一的研究結(jié)果提示，HIV感染后T細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)升高，CXCR4表達(dá)水平降低。本研究結(jié)果表明，相較HIV未治療人群，益艾康膠囊能在一定程度上提高患者CD4水平，同時(shí)降低其血漿病毒載量水平。HIV-1感染后T細(xì)胞表面CCR5和CXCR4的表達(dá)情況與疾病進(jìn)展和機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)，益艾康治療能在一定程度上恢復(fù)CD8+T細(xì)胞表面CCR5和CXCR4的表達(dá)。HIV感染導(dǎo)致輔助受體表達(dá)水平變化的確切機(jī)制目前尚不明確，有研究者認(rèn)為輔助受體變化可能與HIV感染后引起機(jī)體應(yīng)激性異常免疫反應(yīng)有關(guān)。在HIV感染中，淋巴細(xì)胞表面CD38和HLA-DR表達(dá)上升，活化明顯增高，第二受體CCR5主要表達(dá)在活化的淋巴細(xì)胞表面，而CXCR4則主要表達(dá)在靜息細(xì)胞表面，相應(yīng)導(dǎo)致輔助受體CCR5表達(dá)增高，CXCR4表達(dá)降低[14]。本研究基于CD8+T淋巴細(xì)胞表面輔助受體(CCR5、CXCR4)與細(xì)胞活化水平(CD38和HLA-DR)關(guān)聯(lián)性分析，初步探討了輔助受體表達(dá)與T細(xì)胞活化水平的關(guān)系。結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞表面輔助受體CCR5表達(dá)與細(xì)胞活化水平成正相關(guān)，CXCR4表達(dá)與細(xì)胞活化水平成負(fù)相關(guān)。與未治療人群比較，益艾康治療可在一定程度上恢復(fù)感染者T細(xì)胞輔助受體及活化水平，改善艾滋病病毒感染后的免疫損傷。

綜上，隨著疾病進(jìn)展，HIV感染者CD8+T淋巴細(xì)胞活化水平及輔助受體的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞活化水平與輔助受體表達(dá)的確切因果關(guān)系及其明確機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。益艾康治療可部分恢復(fù)輔助受體和細(xì)胞活化水平的變化，改善病人的免疫損傷，這為益艾康的作用機(jī)制研究提供了思路。