葛文靜，王慧森，劉 明，魏 征，梁瑞峰，李更生

(河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004)

肝纖維化是由不同病因引起的肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，臨床通過治療可逆轉(zhuǎn)和改善肝纖維化。然而如果肝纖維化持續(xù)加重發(fā)展為肝硬化，則不可逆轉(zhuǎn)，因此積極治療和逆轉(zhuǎn)纖維化是阻止肝臟疾病加重的關(guān)鍵。中藥的成分具有多樣性，其靶點(diǎn)也表現(xiàn)為多元化，在肝纖維化的治療方面成為研究熱點(diǎn)[1-3]。中醫(yī)治療過程中，通過引經(jīng)藥的應(yīng)用，可提高君藥及其有效成分的靶向性，從而影響療效。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，大黃、丹參均有抗纖維化的作用，因此本課題選用大黃、丹參作為藥物對照組，配伍足厥陰肝經(jīng)引經(jīng)藥柴胡，觀察柴胡對大黃-丹參藥對抗肝纖維化的增效作用。

1 材料

1.1 藥物與試劑

大黃、丹參、柴胡購自河南順康醫(yī)藥有限責(zé)任公司；Masson染色、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、羥脯胺酸(HYP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)一抗購自武漢博士德生物工程有限公司；層黏連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)等試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

冷凍離心機(jī)2K15型(德國Sigma公司)；酶標(biāo)儀Synergy NEO型(美國Bio-Tek公司)；顯微鏡CX31型(奧林巴斯公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

大黃-丹參藥對提取液和柴胡提取液根據(jù)文獻(xiàn)中方法[4]，用70%乙醇加熱回流提取，并分別調(diào)整藥物濃度為含生藥1.0 g·mL-1和0.3 g·mL-1。

2.2 模型復(fù)制與給藥

實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、大黃-丹參藥對組(簡稱藥對組)、藥對+柴胡低、中、高劑量組。購買雄性SD大鼠，180～200 g，每組10只按體質(zhì)量進(jìn)行隨機(jī)分組。參考文獻(xiàn)中[5-6]方法造模，大鼠按2 mL·kg-1的量注射30%CCl4橄欖油溶液至腹腔，每周2次，共7周。從注射造模的第3周分別開始灌胃給藥，大黃-丹參藥對組(5.0 g·kg-1)、藥對+柴胡低劑量組(5.0 g·kg-1+0.75 g·kg-1)、藥對+柴胡中劑量組(5.0 g·kg-1+1.5 g·kg-1)和藥對+柴胡高劑量組(5.0 g·kg-1+3.0 g·kg-1)，每天1次，連續(xù)給藥6周。末次給藥后用10%水合氯醛麻醉，收集血清及肝臟。血清-20 ℃分裝保存，肝臟分為兩部分，分別用10%中性甲醛固定和-80 ℃保存。

2.3 肝組織形態(tài)的觀察

肝組織固定、包埋、切片、HE染色后觀察其病理學(xué)改變， 通過Masson染色法對肝組織中膠原纖維進(jìn)行染色及分析。按照參考文獻(xiàn)中王晶晶等[7]肝纖維化評估標(biāo)準(zhǔn)對大鼠肝纖維化程度進(jìn)行評估。

2.4 肝臟功能和纖維化標(biāo)志物檢測

根據(jù)微板法試劑盒說明書按步驟進(jìn)行操作，檢測血清中肝功相關(guān)指標(biāo)及ALT、ALP、AST的活性；通過ELISA法測定血清中LN、PCⅢ和HA表達(dá)的改變，酸水解法測定肝勻漿液中HYP的含量。

2.5 肝組織中TGF-β1的表達(dá)

肝組織蠟塊切片，脫蠟處理后進(jìn)行抗原修復(fù)，之后對內(nèi)源性過氧化氫酶進(jìn)行滅活，封閉后滴加TGF-β1一抗，置于37 ℃過夜，同時(shí)滴加對應(yīng)的二抗孵育20 min后進(jìn)行DAB顯色。采用Image-Pro Plus 6.0測定積分光密度值(integrated optical density，IOD)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 肝組織形態(tài)的改變

圖1顯示，空白組SD大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)顯示出放射狀排列，無壞死、膠原纖維增生、淋巴細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象發(fā)生。與空白組比較，模型組SD大鼠的肝小葉明顯紊亂，肝細(xì)胞大量壞死，并伴有大片的浸潤和膠原纖維增粗增厚等結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象。與模型組比較，藥物組SD大鼠的肝細(xì)胞排列相對整齊，壞死、浸潤等結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象呈現(xiàn)出不同程度的改善，藥對+柴胡組肝小葉結(jié)構(gòu)改善更明顯。

注：A. 空白組；B. 模型組；C. 藥對組；D. 藥對+柴胡低劑量組；E. 藥對+柴胡中劑量組；F. 藥對+柴胡高劑量組圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較(HE ×200)

圖2顯示，空白組SD大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，僅有少量膠原纖維沉積在匯管區(qū)附近。模型組SD大鼠的肝細(xì)胞變性、壞死、排列紊亂，肝組織中可見大量的膠原纖維形成，甚至互相連接形成纖維縱隔，將肝組織分割成完全或不完全的假小葉。藥物干預(yù)后可見，藥對組、藥對+柴胡組肝組織中變性肝細(xì)胞和膠原纖維染色減少，結(jié)構(gòu)破壞有所減輕，肝纖維化有不同程度的改善。表1顯示，與藥對組比較，藥對+柴胡組纖維化改善更明顯。

注：A. 空白組；B. 模型組；C. 藥對組；D. 藥對+柴胡低劑量組；E. 藥對+柴胡中劑量組；F. 藥對+柴胡高劑量組圖2 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較(Masson ×100)

3.2 肝臟功能指標(biāo)的改變

表1 大鼠肝組織膠原纖維增生的分級

表2顯示，與空白組比較，模型組SD大鼠血清中ALP、ALT和AST活性均明顯升高，各藥物組較模型組有所降低，而藥對+柴胡組血清中ALP、ALT、AST水平較藥對組降低更明顯，效應(yīng)更強(qiáng)。

3.3 肝纖維化指標(biāo)的改變

表3顯示，模型組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ及肝組織勻漿液中HYP的表達(dá)較空白組顯著上調(diào)。與模型組比較，各藥物組LN、HA、PCⅢ和HYP的表達(dá)均有下調(diào)，藥對+柴胡組降低更明顯。

表2 各組大鼠血清ALT，AST和ALP活性比較

注：與空白組比較：1)P<0. 01；與模型組比較：2)P<0. 01；與藥對組比較：3)P<0. 05，4)P<0. 01

表3 各組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量比較

注：與空白組比較：1)P<0. 01；與模型組比較：2)P<0. 01；與藥對組比較：3)P<0. 05，4)P<0. 01

3.4 大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的改變

圖3表4顯示，空白組TGF-β1蛋白表達(dá)量較少。模型組切片中棕色顆粒明顯增多，TGF-β1表達(dá)明顯上調(diào)。與模型組比較，各給藥組切片的棕色顆粒相對減少，TGF-β1表達(dá)不同程度下調(diào)，藥對+柴胡組TGF-β1的表達(dá)減少更明顯。

注：A. 空白組；B. 模型組；C. 藥對組；D. 藥對+柴胡低劑量組；E. 藥對+柴胡中劑量組；F. 藥對+柴胡高劑量組圖3 各組大鼠肝組織中TGF-β1表達(dá)比較

4 討論

肝纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積為特征的可逆性肝損傷，然而纖維化繼續(xù)發(fā)展變成肝硬化則不可逆。因此，積極治療和逆轉(zhuǎn)纖維化是阻止肝臟疾病加重的關(guān)鍵。肝纖維化過程復(fù)雜、靶點(diǎn)繁多，單一靶點(diǎn)的藥物并不能很好地控制病情。中藥的成分復(fù)雜多樣，可以從各方面、多機(jī)制共同作用，更好地對肝纖維化進(jìn)行預(yù)防及治療[2-3]。中醫(yī)治療過程中，常通過引經(jīng)藥的應(yīng)用提高君藥及其有效成分的靶向性，從而增強(qiáng)療效。

表4 各組大鼠肝組織中TGF-β1表達(dá)比較

注：與空白組比較：1)P<0. 05；與模型組比較：2)P<0. 01；與藥對組比較：3)P<0. 05，4)P<0. 01

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射CC14復(fù)制大鼠肝纖維化模型，選用柴胡作為引經(jīng)藥，觀察其對大黃-丹參藥對抗肝纖維化的引經(jīng)增效作用。肝臟HE染色結(jié)果顯示，模型組SD大鼠的肝小葉明顯紊亂，肝細(xì)胞大量壞死，并伴有大片浸潤和膠原纖維的增粗增厚等結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象。與模型組比較，藥物組SD大鼠的肝細(xì)胞排列相對整齊，壞死、浸潤等結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象呈現(xiàn)出不同程度的改善，藥對+柴胡組肝小葉結(jié)構(gòu)的改善更明顯。Masson染色結(jié)果進(jìn)一步顯示，藥對+柴胡組膠原纖維沉積及肝小葉破壞較模型組改善更明顯，提示柴胡作為引經(jīng)藥，可提高大黃-丹參的抗肝纖維化作用。

通常情況下，大量的ALT、AST、ALP及γ-GGT等代謝酶類聚集在肝細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)外界因素作用于肝細(xì)胞引起肝損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，胞內(nèi)的各種代謝酶等透過細(xì)胞膜進(jìn)入血液。因此，檢測血清中ALT、AST、ALP的水平，可間接反映肝功能損傷的程度[8]。而血清中的LN、HA、PCⅢ是膠原蛋白、蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，檢測血清中LN、HA、PCⅢ表達(dá)增多，提示ECM在肝臟中沉積較多，纖維化程度較嚴(yán)重。HYP作為膠原蛋白特有的組成成分，與肝臟纖維化的程度成正相關(guān)[7-9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后大鼠血清中ALT、AST、ALP、LN、HA、PCⅢ表達(dá)降低，肝勻漿中HYP含量減少，藥對+柴胡組較藥對組降低更明顯。

TGF-β1因子在肝纖維化調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β1通過激活肝星狀細(xì)胞(HSC)促進(jìn)膠原蛋白、蛋白多糖、纖維連接蛋白等合成，形成ECM并大量沉積。同時(shí)，TGF-β1通過促進(jìn)HSC分泌MMP抑制劑，減少ECM的降解。ECM的合成與降解失去平衡，從而加速肝纖維化的發(fā)展[10-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組大鼠肝臟中TGF-β1表達(dá)下調(diào)，藥對+柴胡組下調(diào)更明顯，提示大黃-丹參藥對作用于CCl4所致的肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1的蛋白表達(dá)，從而減少基質(zhì)膠原的合成與沉積有關(guān)。而柴胡作為引經(jīng)藥可增強(qiáng)大黃-丹參藥對抗肝纖維化的作用，在治療肝纖維化時(shí)具有引經(jīng)增效作用。

綜上所述，大黃-丹參藥對能明顯改善SD大鼠的肝纖維化程度，柴胡作為引經(jīng)藥可增強(qiáng)其療效，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)，從而減少基質(zhì)膠原的合成與沉積有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。