劉蓉芳，張 輝，譚 雄，聶孝平，劉建和，毛以林△

(1. 江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長沙 410005；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007)

慢性心力衰竭(CHF)涉及血流動力學(xué)、神經(jīng)激素、遺傳因素、能量代謝等多種病理因素。心肌微血管及微循環(huán)功能作為“第二心臟”參與心衰病變過程。各種病因引起的心肌微血管結(jié)構(gòu)破壞，均可引起微血管損傷及微循環(huán)功能障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致局部臟器功能如心功能不全、心梗等[1]。臨床ACEI及ARB類藥物可在一定程度逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮重構(gòu)，但很多患者不能耐受其副作用或因禁忌癥而導(dǎo)致藥物停服，故探討安全有效的中藥保護(hù)心臟血管內(nèi)皮功能，有利于指導(dǎo)臨床，提高臨床療效。

心肌微血管主要功能結(jié)構(gòu)為內(nèi)皮細(xì)胞。大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)具有強(qiáng)烈的收縮血管作用，能引起心肌、心室結(jié)構(gòu)的改變，引發(fā)心室重塑[2]，與心衰嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[3]。血管性血友病因子(vWF)在調(diào)節(jié)血小板黏附于受損內(nèi)皮過程中起關(guān)鍵作用，與內(nèi)皮受損成正比，是內(nèi)皮受損的一個敏感分子標(biāo)志物[4]，是測定內(nèi)皮細(xì)胞功能受損的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(PECAM-1)又稱CD31，具有調(diào)控血管通透性、介導(dǎo)炎細(xì)胞滲入局部組織作用，其表達(dá)水平升高，可促進(jìn)白細(xì)胞的遷移和穿越內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷[6]，從而致使左心室功能下降，與心力衰竭的預(yù)后正相關(guān)[7-8]。因此，本研究著重研究心康沖劑對慢性心衰大鼠心肌微血管內(nèi)皮ET-1、vWF、CD31的干預(yù)作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠90只購自湖南斯克達(dá)實驗動物有限公司(合格證號43004700025095),飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，體質(zhì)量150～180 g，雌雄各半。

1.2 藥品及儀器

注射用鹽酸阿霉素(深圳萬樂)，纈沙坦膠囊(北京諾華制藥)，ELISA試劑盒(武漢博士德)，酶標(biāo)儀(上海研卉)，MoticB5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪)，OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡(日本)，LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)，便攜式彩色多普勒超聲儀(徐州大為DW-PF522)。

2 方法

2.1 動物造模及分組

動物適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)取10只為正常組，余下大鼠依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]行阿霉素造模。左心室短軸縮短率(LVFS)<30%[10]即為心衰造模成功。模型成功后再按隨機(jī)數(shù)字表法分為阿霉素模型對照組(模型組)、心康沖劑等效劑量組(低劑組)、心康沖劑2倍等效劑量組(中劑組)、心康沖劑4倍等效劑量組(高劑組)、纈沙坦對照組(纈沙坦組)各16只。

2.2 藥物制備及給藥

心康沖劑溶液配制：白參10 g，黃芪30 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，陳皮10 g，桂枝6 g，制附片10 g，砂仁6 g，經(jīng)湖南省中醫(yī)院藥劑科制成干燥顆粒后，配制成心康沖劑低、中、高劑量濃度分別為0.6 g/ml、1.2 g/ml、2.4 g/ml的溶液；纈沙坦膠囊成人劑量80 mg/d，纈沙坦膠囊溶液配成濃度為1.62 mg/ml的溶液，貯存于4 ℃冰箱備用。大鼠給藥劑量按人與動物體表面積折算[11]，灌胃量=給藥劑量/各組相應(yīng)溶液濃度，每次灌胃約1～2 ml。正常組、模型組給予等量生理鹽水灌服每天1次，8周后實驗結(jié)束進(jìn)行取材。

2.3 指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 心臟超聲檢測心功能 大鼠用10%水合氯醛溶液按3 ml/kg體質(zhì)量麻醉后固定，前胸備皮涂搽脫毛膏及耦合劑，DW-PF522彩色多譜勒超聲診斷儀取大鼠左心室長軸切面后進(jìn)行M超聲檢測，連續(xù)記錄10個心動周期，測量左室舒張期內(nèi)徑(LVIDd mm)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs mm)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)和心輸出量(CO),所有數(shù)據(jù)均測量3次并取其平均值記錄。

2.3.2 心臟血流動力學(xué) 大鼠行心臟彩超，取頸部正中縱行切口，止血鉗鈍性分離出右側(cè)頸總動脈1.5～2 cm，結(jié)扎頸動脈遠(yuǎn)心端，夾閉近心端。用充滿肝素水的動脈導(dǎo)管沿動脈血管平行推進(jìn)，以電腦顯示屏見振幅高大、波寬較大的心室內(nèi)壓力波為標(biāo)志，停止推送導(dǎo)管，穩(wěn)定數(shù)分鐘后記錄心室壓力曲線，計算平均心室收縮壓(mLVSP)、平均心室舒張壓(mLVDP)、平均心室內(nèi)壓最大上升速率(mdp/dtmax)和平均等容舒張期室內(nèi)壓最大下降速率(-mdp/dtmax)，各組數(shù)據(jù)前后比較差異。

2.3.3 HE染色 大鼠頸動脈取血后打開胸腔，取出心臟組織一部分放入10%多聚甲醛固定1周，蒸餾水沖凈標(biāo)本殘留甲醛后，依次脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，先蘇木精染液染色7 min，用自來水里沖洗2 min，75%的鹽酸酒精分化15 s，自來水沖洗1 min，氨水處理30 s，自來水沖洗1 min，酸化伊紅乙醇液染色12 min，自來水快速沖洗，梯度脫水、透明、封片。

2.3.4 免疫熒光染色 大鼠心臟切片、脫蠟、水化，PBS洗3次每次3 min。再以0.3%H202(甲醇)稀釋5 min,5%FBS-PBS封閉30 min。吸去封閉液加入一抗(vWF、ET-1、CD31)4 ℃過夜，抗體稀釋比例為1∶800,PBS洗3次×5 min,加二抗(羊抗兔FITC，藍(lán)色熒光，1∶1000稀釋)置于密閉盒內(nèi)，30 min后取出玻片至玻架上，用pH7.4的PBS洗3次，取出玻片用濾紙吸去多余水分，加甘油一滴蓋玻片覆蓋，立即熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.3.5 ELISA法檢測血清vWF、ET-1、CD31水平 大鼠頸動脈取血后靜置1 h，高速離心機(jī)3000 r/min，室溫離心20 min后取上清，ELISA法檢測操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心臟超聲值差異比較

表1顯示，與正常組比較，阿霉素心衰模型組LVIDd、LVESD明顯增大，而LVFS、LVEF及CO下降(P<0.05)；與模型組比較，低、中劑量組、纈沙坦組LVIDd、LVESD明顯下降(P<0.05)，LVFS、LVEF及CO明顯增大(P<0.05)，高劑量組LVIDd、LVESD、LVFS指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與纈沙坦組比較，中劑組LVIDd增大(P<0.05)，低劑組LVESD減小(P<0.05)，高劑組LVESD增大(P<0.05)，中高劑組LVFS減小(P<0.05)，低、高劑組LVEF減小(P<0.05)，高劑組CO明顯減小(P<0.05)。

表1 各組大鼠心臟彩超比較

注：與模型組比較:*P<0.05；與正常組比較:#P<0.05；與纈沙坦組比較：▲P<0.05

3.2 各組大鼠血流動力學(xué)比較

表2顯示，與正常組比較，模型組LVAP、dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組及纈沙坦組LVAP、dp/dtmax、-dp/dtmax明顯增高(P<0.05)，LVEDP明顯降低(P<0.05)。與纈沙坦組比較，高劑量組LVAP、dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯增高(P<0.05)。

表2 各組大鼠心臟血流動力學(xué)比較

注：與模型組比較:*P<0.05；與正常組比較:#P<0.05；與纈沙坦組比較：▲P<0.05

3.3 HE染色

圖1顯示，400×光鏡下，正常心肌細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核成藍(lán)色、梭形，肌纖維排列整齊，血管形態(tài)規(guī)則完整、整齊。與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞及血管形態(tài)形態(tài)輪廓模糊，排列紊亂有核融，炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生嚴(yán)重；與模型組比較，低、中劑量組及纈沙坦組心肌細(xì)胞輪廓較清晰，炎細(xì)胞浸潤較輕，血管形態(tài)較清晰。而高劑量組心肌細(xì)胞輪廓相對較模糊，炎細(xì)胞浸潤較多，血管形態(tài)欠清晰。

圖1 HE染色(大鼠左心室橫切面，400×)

3.4 血清ET-1、vWF、CD31水平

表3顯示，與正常組比較，模型組ET-1、vWF、CD31水平升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組及纈沙坦組ET-1、vWF、CD31水平均下降(P<0.05)；與纈沙坦比較，高劑量組ET-1、vWF水平升高(P<0.05)，其余各組指標(biāo)無差異。

表3 各組大鼠血清ET-1、vWF、CD31水平比較

注：與模型組比較:*P<0.05；與正常組比較:#P<0.05；與纈沙坦組比較：▲P<0.05

3.5 免疫熒光染色

圖2顯示，400×熒光鏡下，正常組大鼠心肌細(xì)胞完整，肌束排列整齊，未見ET-1、vWF、CD31陽性表達(dá)熒光點。與正常組比較，模型組心肌及血管細(xì)胞形態(tài)形態(tài)輪廓模糊，其間可見ET-1、vWF、CD31陽性表達(dá)的熒光分布；低、中劑量組及纈沙坦組心肌細(xì)胞輪廓欠清晰，ET-1、vWF、CD31陽性表達(dá)較少；而高劑量組細(xì)胞輪廓相對較模糊，ET-1、vWF、CD31陽性表達(dá)相對低、中劑量組多。

圖2 各組大鼠左心室橫切面免疫熒光比較(400×)

4 討論

慢性心力衰竭為心血管疾病晚期共有的終末器官損害，目前中國慢性心力衰竭患病率為0.9%[12]，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的重點問題。臨床實踐證實，中醫(yī)藥對改善心衰的預(yù)后具有良好的臨床療效。毛以林經(jīng)過長期的臨床實踐，深入研究慢性心衰病變發(fā)生發(fā)展規(guī)律，提出“溫補(bǔ)腎陽、健脾滲濕、溫陽化氣”的治療原則[13]，心康沖劑以真武湯、升陷湯及參苓白術(shù)散為基礎(chǔ)方。方中白參、黃芪升補(bǔ)下陷之宗氣為君，茯苓、薏苡仁甘淡健脾利水為臣；生姜皮、大腹皮專利肌膚之水，砂仁化濕運(yùn)脾，陳皮理氣，因氣能行水化水，制附片溫陽化飲，桂枝溫陽化氣為佐，柴胡、升麻提升清陽之氣，桔梗為舟揖之藥，載諸藥上達(dá)而至病所為使，諸藥和而為功能有效治療慢性心衰[14]。

微血管是血液和組織細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換的場所，心肌微血管的結(jié)構(gòu)功能正常與否直接關(guān)系到心肌組織血氧供需。心血管常見危險因素和炎癥標(biāo)志物增加均可引起冠狀動脈微血管功能障礙有關(guān)[15]，引發(fā)心肌微循環(huán)灌注不足[16]，進(jìn)一步導(dǎo)致心功能不全、心梗等[1]。

內(nèi)皮細(xì)胞是心肌微血管的重要功能結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)隨著心衰的發(fā)生發(fā)展，內(nèi)皮細(xì)胞損傷逐漸加重。ET-1是一種調(diào)節(jié)心血管功能的重要多肽分子，存在于血管內(nèi)皮及各種組織、細(xì)胞中，具有強(qiáng)烈收縮血管作用。有研究認(rèn)為，ET-1能促使心肌細(xì)胞肥大和心臟成纖維細(xì)胞增殖[2]，從而引起心肌、心室結(jié)構(gòu)的改變，引發(fā)心室重塑，研究顯示[3]ET-1水平與心衰嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。vWF主要是由內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種多聚糖蛋白，在調(diào)節(jié)血小板黏附于受損內(nèi)皮過程中起關(guān)鍵的作用。內(nèi)皮受損時，vWF表達(dá)增加，因此vWF水平是內(nèi)皮受損的一個敏感分子 標(biāo)志物[4]，是測定內(nèi)皮細(xì)胞功能受損的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，血漿vWF水平則越高提示內(nèi)皮功能受損越嚴(yán)重[17]。CD31+是目前已知血小板上惟一的細(xì)胞黏附分子，存在于血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處，CD31+在內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放入血，通過增加白細(xì)胞的黏附和遷移，增強(qiáng)內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，促使內(nèi)皮細(xì)胞功能不全[18]，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗塞、心室重構(gòu)和心力衰竭，可以作為一種獨立危險因素參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[8]，并可能對預(yù)后起關(guān)鍵作用[19]。

本實驗中，阿霉素腹腔注射造模后大鼠LVIDd、LVESD明顯增大，而LVFS、LVEF、LVEDP及CO、LVAP、dp/dtmax、-dp/dtmax明顯下降，大鼠心肌收縮力下降，射血分?jǐn)?shù)下降，說明心衰造模成功。同時血清及免疫熒光染色亦提示，ET-1、vWF、CD31水平升高，表明心衰大鼠存在心肌微血管及血管內(nèi)皮損傷。而給予心康沖劑以后，LVIDd、LVESD明顯減小，而LVFS、LVEF及CO上升，低、中、高劑量3組ET-1、vWF、CD31水平均下降，提示心康沖劑可以保護(hù)心衰大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌微血管，提高心衰大鼠心功能，這可能是心康沖劑治療慢性心衰的機(jī)制之一。與纈沙坦組比較，心康沖劑高劑量降低ET-1、vWF水平略差，說明心康沖劑低、中、高劑量在改善心功能及干預(yù)ET-1、vWF、CD31水平作用中均有一定差異性，并在部分指標(biāo)上存在負(fù)性量效關(guān)系，說明心康沖劑低、中、高劑量存在有效劑量(安全劑量)與毒性劑量(副作用劑量)的關(guān)系，因此今后有必要增大樣本數(shù)，進(jìn)一步研究心康沖劑有效療效的最佳劑量，從而為提高臨床療效提供參考。

慢性心衰應(yīng)用中藥既可以提高臨床療效，也可減輕西藥的副作用。本實驗證明，心康沖劑具有保護(hù)心肌微血管及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，可以為中藥新藥開發(fā)及應(yīng)用前景提供一定的依據(jù)。