王身菊，唐麗君，邵 馨，朱美鳳，鄭宏香，陳 岱

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州 213000)

慢性腎臟病(chronic kidney disease CKD)是臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率和病死率逐年升高，已成為目前全球亟待解決的健康問題[1]。原發(fā)性腎小球疾病、糖尿病腎病、梗阻性腎病等各種CKD的結(jié)局都是腎纖維化，如何防治腎纖維化是大家面對的共同難題。中醫(yī)中藥在防治腎纖維化方面有一定的優(yōu)勢，本課題組采用保元排毒丸治療CKD患者，取得了較滿意的臨床療效[2-4]。本研究通過制作UUO大鼠腎臟纖維化模型，觀察保元排毒丸對UUO模型大鼠腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的影響，以探討保元排毒丸延緩腎纖維化的可能機(jī)理。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠48只，7～8 周齡，體質(zhì)量(190±8) g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(動物生產(chǎn)許可證號碼SCXK(蘇)2016-0002)。進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，自由飲水，日常光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)入實驗。

1.2 實驗藥品

保元排毒丸(藥物批號160902)來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，由生黃芪70 g、黃精35 g、冬蟲夏草3. 5 g、生曬參1.75 g、生大黃21 g、丹參35 g、六月雪70 g、接骨木70 g等藥物組成，水泛蜜丸，每丸重 0.14 g，相當(dāng)于生藥含量的0.38 g。厄貝沙坦(商品名：安博維)150 mg/片，由賽諾菲杭州制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要試劑

蘇木素-伊紅染液、Masson染色試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)，DAB 顯色試劑盒(DAKO)，TRIS(Solarbio T8060)，Trizol Reagent、BCA蛋白定量檢測試劑盒及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，兔源性E-cadherin抗體(三鷹公司，貨號20874-1-AP)，鼠源性а-SMA抗體(Boster，貨號BM0002)。

1.4 主要儀器

JJ-12 J型脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，烤箱、RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，NIKON ECLIPSE CI正置光學(xué)顯微鏡。752-P紫外分光光度計(上?，F(xiàn)科儀器有限公司)，neofuge 15R冷凍離心機(jī)(heal force)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)，alphaEaseFC灰度分析軟件(Alpha Innotech)，Stepone plus熒光定量PCR儀(ABI)，多樣品研磨珠均質(zhì)儀(Omni)。

2 方法

2.1 分組及UUO大鼠模型建立

48只健康清潔級雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、UUO組、保元排毒丸低劑量組、保元排毒丸中劑量組、保元排毒丸高劑量組和厄貝沙坦組6組各8只。除假手術(shù)組外，其余各組均按文獻(xiàn)方法[5]造模。以3%戊巴比妥鈉，按照0.2 m L/100 g 腹腔注射麻醉，麻醉成功后固定大鼠，剃去右背部毛發(fā)暴露皮膚，聚維酮碘消毒皮膚3遍，鋪無菌手術(shù)巾。在距脊柱約1～1.5 cm，肋緣下做長約 1～1.5 cm縱行切口，逐層剝離皮下筋膜，切開肌肉暴露出腎盂及輸尿管，玻璃分針分離出右輸尿管，近腎盂處結(jié)扎輸尿管2次，從兩結(jié)扎中間剪斷輸尿管后逐層縫合關(guān)閉腹腔，以聚維酮碘消毒皮膚切口，用無菌敷料覆蓋包扎。假手術(shù)組只分離右輸尿管不結(jié)扎，然后逐層縫合。

2.2 給藥

將保元排毒丸溶于蒸餾水中，分別配成濃度為25%、12.5%、6.25%的溶液，放置冰箱冷藏以備用。造模第2天開始給藥共灌胃14 d，保元排毒丸低、中、高劑量組分別給予保元排毒丸1.25 g·kg-1d-1、2.5 g·kg-1d-1、5.0 g·kg-1d-1，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦12.5 mg·kg-1d-1，假手術(shù)組和UUO組給予自由進(jìn)食及等容積生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 尿蛋白、血肌酐、尿素氮測定 于末次灌胃后放入代謝籠，禁食不禁水，收集24 h尿液，紙片法測24 h尿蛋白定量；末次灌胃24 h后眼眶采血，并通過全自動生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮。

2.3.2 腎組織病理 于末次灌胃24 h后同前法麻醉后取右腎剔除包膜，用無菌紗布吸干水分，電子天平稱取右側(cè)腎臟濕重后，縱切一半右腎置于4%多聚甲醛中固定；右腎另一半分裝于EPP管中于-80 ℃保存，待進(jìn)一步檢測。固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切4.0 μm薄片。按試劑盒方法進(jìn)行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察腎臟病理學(xué)改變，按Banff 分級進(jìn)行 0～3級半定量計分，記錄連續(xù)不重疊的10個200 倍視野數(shù)值，取其平均值比較每例切片的腎小管間質(zhì)區(qū)域病變程度及腎纖維化程度。

2.3.3 免疫組化測腎組織E-cadherin、а-SMA表達(dá) 將4 μm石蠟切片脫蠟至水后，沸水浴實施抗原修復(fù)15 min， PBS(PH7.4)洗滌3次，每次5 min；3%過氧化氫溶液(雙氧水：純水=1∶9)，室溫避光孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min； 3% BSA封閉，加相應(yīng)的一抗 (E-cadherin抗體1∶200，α-SMA抗體1∶100稀釋)，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜；PBS(PH7.4)洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗完全覆蓋切片組織，于37 ℃ 下孵育45 min，PBS洗滌3次，二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 顯色，蘇木素淡染細(xì)胞核1 ～ 3 min，脫水透明后使用中性樹膠封片；假手術(shù)組用PBS代替上述一抗。顯微鏡下以棕黃色顆粒為陽性，每張切片在高倍鏡(200倍) 下隨機(jī)選取10 個不重疊視野。使用Image Pro-Plus 6 軟件測定累積光密度(integrated optical density，IOD)為統(tǒng)計值進(jìn)行半定量分析。

2.3.4 Western Blot法測腎組織E-cadherin、а-SMA表達(dá)水平 取保存于-80 ℃的腎組織，用冷PBS洗滌2～3次，去除血污剪成小塊置于勻漿器，加入適量裂解液后冰上徹底勻漿。1500 g離心10 min，收集上清即為總蛋白溶液，BCA法測蛋白濃度。每上樣孔加4 μg 總蛋白行10% SDS-PAGE 膠電泳。濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用封閉液封閉1 ～ 2 h后，各組分別加入適當(dāng)稀釋后的E-cadherin(1∶2000)、а-SMA(1∶2000)抗體4 ℃ 過夜。辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗用TBST稀釋3000倍，室溫孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑 ECL 反應(yīng)5 min曝光，掃描蛋白條帶，將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析所測得的各指標(biāo)吸光度與內(nèi)參照GAPDH吸光度的比值代表定量值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

保元排毒丸高劑量組在造模過程中因麻醉而死亡1只。

3.1 尿蛋白、血肌酐、尿素氮測定

表1顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量均有增高(P<0.01)；與UUO組比較，保元排毒丸各劑量組血尿素氮和尿蛋白定量均明顯降低(P<0.01)，保元排毒丸低、中、高劑量組血肌酐有不同程度降低(P<0.05，P<0.01)；保元排毒丸各劑量組之間血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量無明顯差異，保元排毒丸高劑量組尿蛋白低于厄貝沙坦組(P<0.05)。

表1 各組血尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白定量及腎組織E-cadherin和а-SMA比較

注：與假手術(shù)組比較：◆◆P<0.01；與UUO組比較：#P<0.05，##P<0.01；與厄貝沙坦組比較：☆P<0.05

1～6組分別表示假手術(shù)組、UUO組、厄貝沙坦組、保元排毒丸低劑量組、保元排毒丸中劑量組和保元排毒丸高劑量組。

3.2 腎組織 HE 染色和 Masson 染色

圖1顯示，UUO組大部分腎小管管腔擴(kuò)張明顯，腎小管上皮細(xì)胞部分溶解、脫落，部分腎小管萎縮或塌陷，部分可見有蛋白或細(xì)胞管型，腎間質(zhì)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤。保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組見腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤比UUO組減少，腎小管擴(kuò)張減輕(P<0.01)。厄貝沙坦組與保元排毒丸各劑量組的病理變化大致相當(dāng)。

注：A.UUO組； B.假手術(shù)組； C.厄貝沙坦組；D.保元排毒丸低劑量組；E.保元排毒丸中劑量組； F.保元排毒丸高劑量組(下同)圖1 各組大鼠腎組織HE 染色(×200)

圖2顯示，UUO組見增寬的間質(zhì)有較多藍(lán)紫色條索狀膠原沉積，假手術(shù)組腎小管間質(zhì)、小球基底膜及系膜區(qū)無明顯膠原沉積腎；保元排毒丸各劑量組和厄貝沙坦組藍(lán)紫色膠原沉積明顯少于UUO組(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腎組織Msson染色(×200)

3.3 腎組織E-cadherin和а-SMA表達(dá)

圖3表1顯示，假手術(shù)組E-cadherin表達(dá)主要分布于遠(yuǎn)端小管和集合管， 主要位于腎小管上皮細(xì)胞的胞漿基底側(cè)， UUO組E-cadherin表達(dá)明顯弱，非常少量地表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中。與UUO組比較，保元排毒丸各劑量組的E-cadherin蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)，保元排毒丸各劑量組和厄貝沙坦組E-cadherin蛋白表達(dá)無明顯差異。

圖3 各組大鼠腎組織E-cadherin表達(dá)(免疫組化)(×400)

圖4 各組大鼠腎組織а-SMA表達(dá)(免疫組化)(×400)

圖4表1顯示，假手術(shù)組а-SMA表達(dá)以血管為主，腎間質(zhì)及上皮細(xì)胞未見明顯表達(dá)；UUO組а-SMA 表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，以擴(kuò)張的腎小管表達(dá)為強(qiáng)，間質(zhì)亦可見到陽性表達(dá)； 保元排毒丸各劑量組的а-SMA表達(dá)以擴(kuò)張的腎小管為主，間質(zhì)可見少量表達(dá)，明顯少于UUO組(P<0.01)。

3.4 Western Blot法測 E-cadherin、а-SMA表達(dá)

圖5表1顯示，與假手術(shù)比較UUO組E-cadherin表達(dá)明顯減少(P<0.01)，а-SMA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與UUO組比較，保元排毒丸各劑量組的E-cadherin表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，а-SMA的表達(dá)明顯減少(P<0.01)。

圖5 各組大鼠腎組織E-cadherin、а-SMA蛋白的表達(dá)(Western Blot法)注：A.UUO組； B.假手術(shù)組； C.厄貝沙坦組；D.保元排毒丸低劑量組；E.保元排毒丸中劑量組； F.保元排毒丸高劑量組

4 討論

CKD的共同病理表現(xiàn)是腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)，主要表現(xiàn)為小管損傷壞死，膠原、纖維連接蛋白和層黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[6]。常沉積的細(xì)胞外基質(zhì)以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主，主要由肌成纖維細(xì)胞分泌產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，1/3以上的腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞起源于腎小管上皮細(xì)胞[7]。腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，(epithelial-mesenchymal transformation，EMT) 在合成肌成纖維細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[8]。腎小管上皮細(xì)胞在炎癥、缺血、缺氧等因素影響下，丟失上皮細(xì)胞的表型，轉(zhuǎn)化為具有分泌功能的肌成纖維細(xì)胞的過程，即腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)[9]。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成肌成纖維細(xì)胞，直接參與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，是腎纖維化的重要機(jī)制之一[10]。а-SMA是肌成纖維細(xì)胞合成的一種特征性蛋白，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，а-SMA陽性肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的主要細(xì)胞[11]。а-SMA是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。上皮細(xì)胞的黏附能力喪失，Ecadherin表達(dá)缺失或減弱是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志[12]。本實驗選用E-cadherin和а-SMA作為EMT的標(biāo)志。

保元排毒丸為全國名中醫(yī)張志堅治療CKD的經(jīng)驗方。張志堅認(rèn)為，腎病的發(fā)生不外乎先天稟賦異常、后天失養(yǎng)或勞作過度、冒雨涉水受風(fēng)而發(fā)，風(fēng)邪或從上受，或由外而內(nèi)蘊伏于腎，風(fēng)為百病之長，易傷肺脾腎，故肺脾腎虛損常為本病的素因，而以脾腎虛損為重；脾虛生濕，濕蘊成濁、濁聚成毒，久病致瘀入絡(luò)，風(fēng)濕瘀交阻病情纏綿難愈。針對慢性腎衰共性核心病機(jī)“脾腎兩虛、風(fēng)濕瘀阻”，提出脾腎氣陰兩虛、風(fēng)濕瘀阻證為慢性腎衰最常見證型，慢性腎衰的基本治法為益腎健脾、祛風(fēng)清利、化瘀泄?jié)帷?jù)此病機(jī)研制保元排毒丸，主要由生黃芪、黃精、人參、冬蟲夏草、丹參、接骨木、生大黃、六月雪等中藥組成。方中生黃芪補肺固表、利水消腫；黃精平補肺脾腎；人參大補元氣、補脾生津；冬蟲夏草甘溫益氣、保肺補腎；紫丹參活血祛瘀；接骨木祛風(fēng)利濕、活血化瘀；六月雪清熱利濕；生大黃苦寒瀉下、蕩滌腸胃、降泄?jié)嵝?。諸藥相伍，補瀉兼施，清消并用，共奏益腎健脾、祛風(fēng)清利、化瘀泄?jié)嶂?，治療CKD臨床療效可靠[2-4]。

單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型是一種研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制、腎臟細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和評價腎間質(zhì)纖維化療效的理想模型[13]。本實驗UUO組腎小管、腎間質(zhì)病變重，腎纖維化重，表明UUO模型成功，UUO組血肌酐、尿素氮均高于各給藥組。從臨床經(jīng)驗看，單側(cè)輸尿管梗阻不至于引起血肌酐和尿素氮的升高，因為腎臟具有強(qiáng)大的代償能力，這點鼠與人的結(jié)果不太一致。也有學(xué)者[14-15]得出了同樣的實驗結(jié)果，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠術(shù)后2周血肌酐升高，有可能是大鼠對急性腎損傷的代償能力弱于人。UUO組24 h尿蛋白定量升高，保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮均明顯低于UUO組，表明保元排毒丸有降低血肌酐、尿素氮和蛋白尿的作用。保元排毒丸高劑量組蛋白尿水平低于厄貝沙坦組，提示保元排毒丸降蛋白尿的作用可能優(yōu)于厄貝沙坦組，這需要在今后的動物實驗和臨床中進(jìn)一步觀察。與UUO組比較，保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組腎小管、腎間質(zhì)病變明顯減輕，腎纖維化減輕，提示保元排毒丸有延緩腎間質(zhì)纖維化的作用。免疫組化和Western Blot均證實，UUO組E-cadherin表達(dá)減少，а-SMA表達(dá)明顯增多，說明模型組大鼠腎組織發(fā)生了轉(zhuǎn)分化。保元排毒丸低、中、高劑量組E-cadherin表達(dá)明顯高于UUO組，а-SMA表達(dá)明顯低于UUO組，表明保元排毒丸有抑制腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的作用。至于保元排毒丸通過何種途徑抑制腎小管上皮轉(zhuǎn)分化需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，保元排毒丸能降低UUO大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮延緩腎纖維化，其機(jī)理可能與抑制腎小管上皮轉(zhuǎn)分化有關(guān)。