俞 媛 ，楊雅瓊 ，馮凱強 ，屈金輝 ，潘雪梅 ，白 雪 ，王 毅

（1．天津市天津醫(yī)院檢驗科，天津 300211；2．天津市天津醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300211）

骨折愈合是一個十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，歷經(jīng)血腫機化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑形期，其修復(fù)需要充足的血供和骨折端的穩(wěn)定固定。如何縮短骨折愈合時間、及早促進骨折愈合、減少并發(fā)癥的發(fā)生，是骨科界亙古不變的關(guān)注點。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療骨折有著悠久的歷史，且安全、風(fēng)險小、療效確切，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療骨折的強大優(yōu)勢[1－2]。本研究擬通過建立大鼠脛骨干骨折模型，探索蘇氏接骨膠囊（簡稱Su）對骨折早期愈合的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雄性SD大鼠36只（SPF級，天津市中西結(jié)合骨科研究所動物中心提供），體質(zhì)量（200±25）g，采用隨機數(shù)字表法將其分為3組，每組12只，分別為假干預(yù)組、Su－140組和Su－280組。標準鼠糧適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水，室溫（25±2）℃，定期消毒及通風(fēng)。

1.1.2 藥物 Su（天津市天津醫(yī)院藥劑科提供，津藥制字 Z20070616，規(guī)格為每粒 0．25 g）復(fù)方藥物，由骨碎補、土鱉蟲、續(xù)斷、煅自然銅、劉寄奴、川芎、當(dāng)歸、三七粉、五加皮、木瓜、熟地黃、補骨脂、無名異、菟絲子、黨參、黃芪、煅龍骨、白芍和桂枝19味藥物組成。

1.1.3 器材與儀器 一次性無菌注射器（直徑為1mm，碧迪醫(yī)療器械有限公司提供）；大鼠灌胃器（16碼，北京合力科創(chuàng)科技有限公司提供）；金屬克氏針（長150 mm，直徑1．0 mm，北京藍港神舟醫(yī)療器械有限公司提供）；Micro－CT成像系統(tǒng)（1174V2型，SIEMENS公司，比利時）。

1.2 方法

1.2.1 骨折模型的制備 使用10%的水合氯醛行腹腔麻醉和常規(guī)消毒后，無菌條件下于右下肢脛骨內(nèi)側(cè)緣從粗隆間向下縱行切口，長約2 cm，逐層切開皮膚并剝離部分肌肉組織，利用一根5 mL注射器針頭（直徑1 mm）于脛骨髕韌帶開口，插入已消毒的克氏針并沿髓腔至脛骨粗隆間，然后線鋸截斷位于脛骨中段前方最高點，致脛骨中段橫行骨折。將克氏針繼續(xù)插入整個脛骨髓腔（穿過已斷裂的骨折處），剪斷多余的克氏針，遠端埋于骨皮質(zhì)下。碘伏及0．9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗切口后，使用11號絲線逐層縫合切口。

1.2.2 術(shù)后處理 術(shù)后立即在麻醉狀態(tài)下拍攝患肢側(cè)位X線片，觀察造模效果。要求骨折類型為脛骨中段橫行或短斜形骨折，骨折端內(nèi)固定理想無明顯移位。周期定時添足飼料、更換墊料，飲水不限。1.2.3 給藥方法 造模成功后第2天開始通過灌胃方式進行相應(yīng)的藥物治療。給藥劑量經(jīng)人－大鼠體表面積比值折算成等效劑量[140 mg/（kg·d）]，蒸餾水配制相應(yīng)濃度的藥物混懸液。每只大鼠的給藥容積為2 mL，假干預(yù)組給予等量的蒸餾水，每日1次至實驗取材。

1.3 實驗方法和觀察指標

1.3.1 標本取材 骨折造模術(shù)后第10天，3組大鼠過量麻醉，各組隨機抽取6只大鼠行心臟取血備用。所有動物模型處死后，取患側(cè)脛骨全長標本，剔除附著于脛骨干的肌肉，立即行X線檢查。隨后，各組隨機抽取6只進行Micro－CT檢查，剩余6只立即投入10%中性福爾馬林溶液中固定，待用。

1.3.2 骨痂標本觀察 取材后肉眼觀察3組大鼠患側(cè)脛骨的骨痂外形，比較3組大鼠骨痂形成的情況以及骨折端的穩(wěn)定程度。

1.3.3 X線檢查 大鼠患側(cè)取材后立即行脛骨全長X線照片，觀察骨折兩端的變化。使用X線機（XR656型，GE公司，美國）拍攝脛骨側(cè)位X線片，攝片條件為：電壓55 kV，電流 2 mA，曝光時間13 ms。

1.3.4 Micro－CT檢查 將樣本置于Micro－CT測試管內(nèi)，沿標本長軸方向進行掃描，獲取連續(xù)的Micro－CT 圖像，掃描精度：8．52 μm，重建后分辨率：17．2μm，掃描電壓：80 kV，電流 500μA，閾值：1 000，興趣區(qū)：1 600，寬度：2 100。圖像高斯濾波后，以骨折部位為中心進行三維重建。利用Inveon Research Wofkplace分析軟件（SIMENS公司，德國）將得到的三維圖像信息進行定量分析，計算樣本骨痂的骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb．Th）、骨小梁數(shù)量（Tb．N）等。

1.3.5 組織學(xué)觀察 取已置于10%中性多聚甲醛溶液中的患側(cè)標本，25℃下固定1周。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后，將標本置于10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2，DEPC水配制）脫鈣液中進行脫鈣，直至組織軟化為止。脫鈣后用乙醇梯度脫水，使用二甲苯透明處理2 h，石蠟包埋。沿股骨干長軸切片，厚度為5μm，再行蘇木精－伊紅（HE）染色。所用液體試劑均需用DEPC處理或DEPC水配制。每份標本隨機取6張脛骨切片，分別在光學(xué)顯微鏡下觀察骨痂的生長情況。

1.3.6 免疫組化染色 石蠟切片烤片6～8 h后常規(guī)脫蠟，3%H2O2溶液室溫孵育10 min后，枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)，滴加牛血清白蛋白（BSA）封閉液，滴加兔抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（BMP－2）多克隆抗體（博士德產(chǎn)品），4℃過夜，37℃復(fù)溫1 h。滴加生物素二抗，室溫30 min，滴加DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。

1.3.7 實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real Time－PCR） 在mRNA水平上分別測定3組樣本中BMP－2因子的表達量。Trizol法提取總RNA并測定總RNA濃度（OD260/280在 1．6～1．8）。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒（TIANGEN產(chǎn)品），將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA并定量擴增。擴增條件為：預(yù)變性，95℃，1 min；變性，95 ℃，5 s；退火/延伸，58 ℃，15 s。循環(huán)數(shù)40次。內(nèi)參基因為GAPDH。GAPDH引物序列：正義鏈：5’－GGTGCTGAGTATGTCGTGGA－3’，反義鏈：5’－TGCTGACAATCTTGAGGGAG－3’；BMP－2 引物序列：正義鏈：5’－CATCCACTCCACAAACGAGA－3’，反義鏈：5’－GTCATTCCACCCCACATCA－3’（上海生工合成）。采用2－ΔCt公式計算BMP－2的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19．0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示。3組間比較采用單因素方差分析。Micro－CT 結(jié)果中藥物濃度與 BV/TV、Tb．Th、Tb．N 的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線觀察骨痂形成 術(shù)后10 d，3組大鼠的骨折斷端均可見骨痂形成。骨折端愈合尚穩(wěn)定，部分標本骨折斷端微動，經(jīng)X線觀察Su－280組骨折端愈合情況好于Su－140組及假干預(yù)組，Su－140組優(yōu)于假干預(yù)組，見圖1。

圖1 大鼠脛骨X線檢查結(jié)果Fig.1 Resultsof X-ray examination of tibia in rats

2.2 Micro－CT檢查結(jié)果 術(shù)后第10天，3組大鼠BV/TV值差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。Su－140組和Su－280組ROI區(qū)域的BV/TV值均大于假干預(yù)組（P＜0．01）。Su－280 組 BV/TV 值大于 Su－140 組（P＜0．01）。Tb．Th3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。Su－280 組與假干預(yù)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。Su－280組與 Su－140 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。Su－140 組與假干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。Tb．N3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。Su－280 組與假干預(yù)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），Su－280 組與 Su－140 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），Su－140組與假干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。各組 BV/TV、Tb．Th、Tb．N 的數(shù)值與 Su 濃度呈現(xiàn)明顯相關(guān)（P＜0．01），見表 1、圖 2。

表 1 Micro-CT 結(jié)果（x±s）Tab.1 Resultsof Micro-CT（x±s）

圖2 各組大鼠脛骨Micro-CT結(jié)果Fig.2 Micro-CT of tibial of rats in each group

2.3 組織學(xué)觀察 鏡下可見，假干預(yù)組的骨折端有纖維骨痂和軟骨痂形成，但骨小梁較小，間隙較大，結(jié)構(gòu)疏松，血管稀少。Su－140組和Su－280組的骨折端有較多的纖維性和軟骨性骨痂，并在軟骨痂邊緣見到鈣化，可見骨外膜下成骨。同時，大量骨小梁開始形成，骨小梁間隙內(nèi)可見較多的毛細血管。Su－280組毛細血管尤其豐富，且骨小梁的方向開始向著與骨干縱向平行的方向生長，見圖3。

圖3 3組大鼠脛骨骨痂HE染色Fig.3 HEstaining of tibial callusof ratsin threegroups

2.4 免疫組化結(jié)果 3組結(jié)果鏡下顯示，在骨痂內(nèi)軟骨細胞的礦化區(qū)周圍存在著BMP－2的分布區(qū)域，且隨著干預(yù)藥物濃度的增加，區(qū)域面積增大，BMP－2的表達增多。且同假干預(yù)組及Su－140組相比，BMP－2分布增多的Su－280組骨痂內(nèi)軟骨細胞的礦化區(qū)面積增大，骨小梁數(shù)量增多，并趨向沿脛骨干縱軸的方向排列，見圖4。

圖4 3組大鼠脛骨骨痂中BMP-2的表達（免疫組化染色，×100）Fig.4 Expression of BMP-2 in thetibial callus of the three groups(immunohistochemical staining,×100)

2.5 Real Time－PCR結(jié)果 BMP－2在mRNA水平的表達量顯示，3組大鼠的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。其中，Su－280 組 BMP－2 表達量（7 114．75±1 474．67）高于假干預(yù)組（3 228．56±187．86）和 Su－140 組（4 163．96±678．88），差異顯著（P＜0．05），假干預(yù)組同 Su－140 組間差異不顯著（P＞0．05），見表 2。

表2 BMP-2的Real Time-PCR結(jié)果Tab.2 Real Time-PCR resultsof BMP-2

3 討論

意外創(chuàng)傷引發(fā)的骨折最近幾年顯著增多，骨折斷端的快速愈合是減少骨折后并發(fā)癥的關(guān)鍵所在。骨折愈合是骨組織完全再生的過程，其修復(fù)經(jīng)過纖維骨痂、軟骨骨痂至成熟的骨性骨痂階段。骨折早期，在骨折斷端與其周圍形成血腫，富含大量生長因子，并吸引大量炎性細胞浸潤以清除壞死組織，為骨折修復(fù)創(chuàng)造有利條件。BMP－2是唯一能夠單獨誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞向骨組織方向分化的生長因子，是骨組織形成過程中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞的遷徙、增殖、分化，最終導(dǎo)致軟骨形成的作用[3]。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療骨折有著悠久的歷史，且安全、風(fēng)險小、無手術(shù)創(chuàng)傷，填補了西醫(yī)治療骨折的弊端。本研究通過建立大鼠脛骨干骨折模型，骨折愈合過程中給予傳統(tǒng)中藥Su進行治療，結(jié)果顯示，在骨折愈合早期，Su促進了骨痂中BMP－2的表達，進而促進大鼠脛骨干骨折的早期愈合。

Su是天津醫(yī)院臨床常用院內(nèi)制劑（津藥制字Z20070616），由骨碎補、土鱉蟲、續(xù)斷、煅自然銅、劉寄奴、川芎、當(dāng)歸、三七粉、五加皮、木瓜、熟地黃、補骨脂、無名異、菟絲子、黨參、黃芪、煅龍骨、白芍和桂枝19味藥物組成。方中以骨碎補、續(xù)斷、土鱉蟲3味主藥配合，補肝腎、強筋骨、破瘀血、續(xù)折傷，治療骨折損傷、瘀滯疼痛，通過補腎氣以達到主骨生髓、促進骨折愈合的目的，共為君藥。該方劑以骨折三期治則為指導(dǎo)原則，從整體出發(fā)，舒筋活血，補腎壯骨[4－5]。現(xiàn)代研究將傳統(tǒng)中醫(yī)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，已證實活血化瘀能通過增強骨生長因子成纖維細胞生長因子（FGF）－2、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、BMP－2和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）－β1等的表達促進骨折的愈合[6－12]。本研究通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從微觀探討中藥Su促進骨折早期愈合的機制。應(yīng)用傳統(tǒng)的骨影像學(xué)可觀察到大鼠脛骨干骨折早期愈合的情況。經(jīng)Micro－CT技術(shù)[13－14]重建了骨折斷端骨痂的三維圖像，并進行定量分析，得到了骨痂的相關(guān)形態(tài)學(xué)參數(shù)。在離體空間更精確地反映了骨痂形態(tài)和骨痂礦化的過程，明確了蘇氏接骨膠囊對骨折早期愈合的影響深度及愈合程度對該方劑藥物濃度的依賴性。同時，骨痂組織HE染色及免疫組化結(jié)果顯示，同假干預(yù)組比較，給予中藥灌胃治療的實驗組大鼠，其骨折斷端的軟骨細胞礦化區(qū)面積增大，骨小梁數(shù)量增多，血管更加豐富，分布于骨小梁間的BMP－2蛋白更為廣泛。Real Time－PCR的定量檢測結(jié)果顯示，隨著不同劑量中藥的干預(yù)，在mRNA水平上，各組之間BMP－2的表達量存在顯著的差異。BMP－2誘導(dǎo)成骨有3個條件[3]：首先，有效的BMP－2濃度；其次，存在BMP－2的靶細胞群；最后，正常的骨生長環(huán)境。本研究顯示，BMP－2的表達量隨著藥物干預(yù)濃度的增加而增加，骨折愈合的也越好。這有可能是高劑量的BMP－2通過激活以下2個信號通路BMP－2/Smads/Runx2/Osterix或BMP－2/Smads/Msx2/Osterix來促進骨折的早期愈合。

綜上所述，中藥Su能促進大鼠骨折斷端骨痂內(nèi)BMP－2的生成及骨折的早期愈合，在分子生物學(xué)水平為中藥治療骨折愈合提供了有力的實驗證據(jù)。