孫玉濱 趙昱瑋 楊 航 高 娜 韓 威 王艷艷 劉秀華▲

1.吉林天藥本草堂制藥有限公司，吉林長(zhǎng)春 130012；2.吉林省吉測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，吉林長(zhǎng)春 130117

紫金顆粒由水牛角、黃芩、金銀花、紫草、牡丹皮、赤芍、苦參、地黃、仙鶴草、玄參、蟬蛻等11味藥組成，該方由《小品方》中“犀角地黃湯（芍藥地黃湯）”化裁而來(lái)，組方合理，具有清熱解毒，涼血散瘀,用于過(guò)敏性紫癜[1-3]。為了更好地控制該藥品的質(zhì)量，保證該藥的臨床用藥安全，本文采用高效液相色譜法對(duì)紫金顆粒中的黃芩苷、綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定。所建立的方法可靠、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可作為紫金顆粒的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津2010型），紫外檢測(cè)器，高效液相色譜儀（島津2030型），PDA檢測(cè)器；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS210S電子天平（賽多利斯）；黃芩苷對(duì)照品，綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110715-200514，110753-200413）； 紫 金 顆 粒（20160504，20160505，20160507，吉林天藥本草堂制藥有限公司）。甲醇（色譜純），娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 含量測(cè)定[5-8]

2.1 黃芩苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48）；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量10μL，等梯度洗脫，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 黃芩苷回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.1.2 供試品溶液的制備 取紫金顆粒，研細(xì)，稱取粉末約0.2g，精密稱定，置100mL容量瓶中，加70%乙醇約70mL，密塞，超聲提取（功率250W，頻率35kHz）30min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的配制 取在60℃減壓干燥4個(gè)小時(shí)的黃芩苷對(duì)照品6.04mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻線，搖勻，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺少黃芩的陰性模擬處方，按工藝方法制備陰性樣品，取約0.2g，精密稱定，按供試品的制備方法進(jìn)行制備，得到陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芩苷對(duì)照品14.90mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻線，搖勻，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻線，得濃度為0.0596mg/mL的對(duì)照品溶液。

精密吸取0.0596mg/mL的對(duì)照品溶液4、8、12、16、20、24μL注入液相色譜儀測(cè)定峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，黃芩苷量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，y=3569.7x-12.868，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。（n=6）。實(shí)驗(yàn)表明黃芩苷在0.2384～1.4304μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（20160505）樣品6份，按“2.1.2”制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算得黃芩苷的含量，RSD=0.81%（n=6），平均含量為2.63%，表明，此方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取同一為供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芩苷峰面積，計(jì)算RSD=0.35%（n=6），結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一為供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，分別于 0、2、4、8、12h進(jìn)樣，根據(jù)樣品溶液的峰面積考察溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算RSD=0.96%（n=5），結(jié)果表明，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，稱取黃芩苷含量為2.69%的樣品6份，精密稱定，分別加入2.704mg/mL（精密稱取黃芩苷對(duì)照品27.04mg于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。黃芩苷對(duì)照品溶液1mL，按2.1.2項(xiàng)下供試品制備方法制成供試品溶液，按含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定本品的回收率，見表1。

2.1.10 三批樣品含量測(cè)定 按照含量測(cè)定方法，對(duì)3批紫金顆粒樣品中黃芩苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，見表2。

表2 樣品中黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果（%）

2.2 綠原酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（9：91）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃，等梯度洗脫，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1000，色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

表3 綠原酸回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.2.2 供試品溶液的制備 取紫金顆粒，研細(xì)，稱取粉末約0.5g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加50%甲醇約45mL，密塞，超聲提?。üβ?50W，頻率35kHz）30min，放冷，再用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的配制 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中,加50%甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺少金銀花的陰性模擬處方，按工藝方法制備陰性樣品，取約0.5g，精密稱定，按供試品的制備方法進(jìn)行制備，得到陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對(duì)照品6.80mg，置50mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻線，搖勻。精密吸取該對(duì)照品溶液2mL置10mL量瓶中，再加50%甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.0272mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取濃度 為 0.0272mg/mL 的 對(duì) 照 品 溶 液 1、2、5、10、15、20、25μL，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表18。以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=3077284.2x+652.1，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明綠原酸在0.0272～0.6800μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（20160504）樣品6份，按“2.2.2”制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算得綠原酸的含量，RSD=0.39%（n=6），平均含量為0.24%，表明，此方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定綠原酸峰面積，計(jì)算RSD=0.15%（n=6），結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣，根據(jù)樣品溶液的峰面積考察溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算RSD=0.86%（n=5），結(jié)果表明，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取綠原酸含量為0.24%的樣品6份，精密稱定，分別加入0.608mg/mL（精密稱取綠原酸對(duì)照品6.08mg于10mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。）的綠原酸對(duì)照品溶液1mL，按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制成供試品溶液，按含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定本品的回收率，見表3。

2.2.10 三批樣品含量測(cè)定 按照含量測(cè)定方法，對(duì)3批紫金顆粒樣品中綠原酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，見表4。

表4 樣品中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

紫金顆粒由水牛角、黃芩、金銀花、紫草、牡丹皮、赤芍、苦參、地黃、仙鶴草、玄參、蟬蛻等11味藥組成，選擇黃芩苷和綠原酸作為指標(biāo)成分，分別為黃芩和金銀花的專屬有效成分，且專屬性良好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇[4]

通過(guò)紫外的全掃描可以看出黃芩苷在279nm處有最大的紫外吸收，該波長(zhǎng)與《中國(guó)藥典》2015年版一部黃芩“含量測(cè)定”項(xiàng)下規(guī)定的檢測(cè)波長(zhǎng)280nm相接近；綠原酸在327nm處有最大吸收，與《中國(guó)藥典》2015年版一部金銀花“含量測(cè)定”項(xiàng)下規(guī)定的檢測(cè)波長(zhǎng)一致。

3.3 提取方法的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，常用的黃芩苷、綠原酸提取方法主要有回流法與超聲提取法[9-13]，通過(guò)比較，超聲提取法要優(yōu)于回流提取法，故本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法進(jìn)行樣品提取，并對(duì)樣品的提取時(shí)間進(jìn)行了考察，最終確認(rèn)選擇30min作為提取時(shí)間。

3.4 色譜條件的選擇[14-15]

分別對(duì)黃芩苷、綠原酸的流動(dòng)相、色譜柱、柱溫、流速等進(jìn)行了考察。最終選擇甲醇-0.4%磷酸溶液測(cè)定黃芩苷，乙腈-0.4%磷酸溶液測(cè)定綠原酸。

3.5 討論

本文對(duì)紫金顆粒進(jìn)行了黃芩苷和綠原酸的含量測(cè)定研究，建立了紫金顆粒中黃芩苷和綠原酸的高效液相測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)考察，測(cè)定黃芩苷和綠原酸的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可行、專屬性強(qiáng)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。