楊慧麗，楊 露，張懷勝，林亞楠，李 冰，薛亞東

（河南農業(yè)大學農學院，河南 鄭州 450046）

植物細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）是指植物的生殖器官不能產生花藥、花粉、雄配子體或雖有花粉但花粉無活性，但雌器官發(fā)育正常，可接受外來花粉正常結實的一種生物學現(xiàn)象。自Kolreuter 1763年觀察到雄性不育現(xiàn)象以來，已在43科162屬617個物種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象［1-2］。細胞質雄性不育材料是研究核質互作的重要材料，同時是作物生產中的寶貴資源。雜種優(yōu)勢是指兩親本的雜交后代體型、生長率、產量、繁殖力及行為特征方面均比親本優(yōu)越的一種生物學現(xiàn)象，在全世界范圍內的作物生產上，對于雜種優(yōu)勢的利用產生了巨大的經濟效益，有一半以上的農作物種子如玉米、水稻、高粱、油菜和向日葵等都來源于雜交種，因此雜交育種對于世界糧食安全起到了巨大的作用。對于自花授粉作物，如果要生產雜交種子，就要把植株的雄穗去掉，防止自交。去雄包括人工去雄、機械去雄和化學去雄，但都需要投入大量的人力、物力、財力并且污染環(huán)境。然而，如果利用雄性不育系材料作親本來生產雜交種子則免去了人工去雄這項體力勞動，細胞質雄性不育材料已在水稻、玉米等作物的雜交種生產中得到廣泛的應用。利用CMS生產的種子具有更強的雜種優(yōu)勢，在產量、品質、抗逆性等方面都得到了顯著的改良與提高［3］。盡管CMS在生產上已得到廣泛的應用，但其機理的研究卻相對滯后，例如水稻野敗型不育系材料早在20世紀70年代就已發(fā)現(xiàn)并利用，但其不育基因WA352的功能與機理直到最近幾年才被研究清楚［4-5］。另外，在研究細胞質雄性不育的過程中不斷深入探究線粒體的功能，對理解核質間的互作及細胞器之間信號通路等方面都具有重要意義，同時也促進了細胞質雄性不育在雜種優(yōu)勢利用、不育化制種中的應用［6］。本文對近年來發(fā)現(xiàn)的細胞質雄性不育基因的研究進行了概述，并探討了植物細胞質雄性不育研究的發(fā)展前景。

1 細胞質雄性不育系的來源及分類

植物細胞質雄性不育現(xiàn)象的產生不但與植物體自身內在的因素有關，有些也受環(huán)境因素如溫度、光照等的影響。因此不育的表型是環(huán)境因素與植物體自身的細胞核基因組、細胞質基因組綜合作用后而產生的結果。目前已被發(fā)現(xiàn)的細胞質雄性不育主要有3種來源：一是遠緣雜交核置換造成的核質不親和性，二是植物自然繁殖過程中的突變和基因重組，三是回交過程中親本核恢復座位的丟失［52］。目前發(fā)現(xiàn)的眾多不育材料在形態(tài)及細胞學上的敗育表現(xiàn)主要有以下5種形式：一是雄蕊退化或變形；二是孢子囊退化，花藥外形看似正常但不能產生花粉；三是小孢子退化，形成異?；ǚ叟c花粉敗育；四是產生的花粉存在功能缺陷，不能正常萌發(fā)；五是產生的花粉雖然有活力但花藥不開裂［8］。隨著研究的不斷拓展，越來越多不育材料的發(fā)現(xiàn)表明雄性不育現(xiàn)象在高等植物中普遍存在［7］。

盡管不育系種類繁多，遺傳機理多樣且復雜，就細胞質雄性不育的特點而言，主要分為孢子體不育和配子體不育兩種類型。孢子體雄性不育是花粉的育性，受孢子體即植株的基因型所控制，植物的花粉是否正常生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質是由孢子體供給的，而與花粉本身基因無關。配子體雄性不育是受配子體（花粉）基因型所決定。敗育時間發(fā)生在雄胚子階段，花粉可以形成小孢子但在形成雄配子體時，由于營養(yǎng)物質的缺乏而走向敗育［50］。不管是植物體的孢子體還是配子體的花藥組織發(fā)生雄性不育突變后均可以導致其發(fā)育異常，導致雄性不育的產生。研究發(fā)現(xiàn)細胞質雄性不育植株中，大多數(shù)的孢子體不育首先影響了花藥的絨氈層結構和正在進行減數(shù)分裂的細胞，從而導致植物體花粉敗育，相反配子體雄性不育類型中主要是影響了孢子體或花粉粒的發(fā)育而引起的敗育［12］。

2 細胞質雄性不育與雜種優(yōu)勢

雜種優(yōu)勢是指兩親本雜交后，產生的雜交種子在生長勢、生長率、品質、產量、抗逆性、繁殖力等其他方面均優(yōu)于兩親本的一種生物學現(xiàn)象，生產實踐中培育出的一些雜交品種與自交系品種相比產量可以提高15%～50%［13］。然而，在玉米、水稻、小麥等作物的雜交制種過程中，需要將母本植株的雄穗除去，以阻止其自身的花粉落在雌蕊的柱頭而影響制種的純度與質量。因此常規(guī)的雜交種生產過程中，需要消耗大量的人力、物力進行人工去雄，致使制種成本過高。雄性不育植株不能產生有活力的花粉，不能自交繁殖后代，但其雌器官發(fā)育正常，因此可在雜種生產中用來作母本，接受其他外源花粉授精而生產雜交一代種子。育種家們利用不育系的這一特性， 實現(xiàn)農作物的雜交育種和雜種優(yōu)勢的利用。因此，植物雄性不育材料是作物利用雜種優(yōu)勢的遺傳基礎，在農業(yè)生產中產生了重要的應用價值。隨著對雄性不育的進一步研究，生產中利用雄性不育系材料做母來生產雜交種子則免去了人工去雄這項體力勞動，節(jié)約勞動成本，提高制種純度與質量，最大幅度地利用雜種優(yōu)勢提高產量。利用細胞質雄性不育，我國水稻從普通雜交稻生產到“三系法”的雜交稻生產，再到 “兩系法”雜交稻的生產， 使我國的水稻生產一直處于國際領先水平［14］。雜交水稻生產模式的突破、推廣與利用正是得益于我國的農業(yè)科學工作者對雄性不育遺傳材料的發(fā)現(xiàn)、研究、利用和推廣。

生產上推廣應用的“三系法”制種指的是細胞質雄性不育系、細胞質雄性不育保持系和細胞質雄性不育恢復系（圖1）［16］。細胞質雄性不育系中有包含引起不育表型的細胞質基因和缺乏恢復育性的細胞核基因，在農業(yè)生產上被用作母本。細胞質雄性不育保持系的核基因組與不育系相同，但細胞質是正常的，農業(yè)生產上用于與不育系雜交來繁殖不育系從而保持不育系的不育表型。細胞質雄性不育恢復系包含正常的細胞質基因和具有恢復育性的核基因，農業(yè)生產上用來做父本與不育系雜交產生F1代雜交種子，這種雜交模式產生的F1代種子不僅育性得到了恢復而且具有比親本更高的雜種優(yōu)勢，有利于農業(yè)生產中對于品質、產量等其他農藝性狀的需求［16］。

圖1 細胞質雄性不育三系法在生產上的應用

自細胞質雄性不育材料發(fā)現(xiàn)以來，科研工作者們在利用于雄性不育材料改善與提高農業(yè)生產的同時，也對其分子生物學的功能與不育機制進行了大量的研究。細胞質雄性不育性狀是通過胞質遺傳的，細胞核基因與線粒體基因可能是決定細胞質雄性不育的關鍵因素。

隨著現(xiàn)代生物測序技術的發(fā)展，近年來一些作物的線粒體基因組測序相繼完成，發(fā)現(xiàn)高等植物線粒體基因組具有高度的重組型與可變性［17-19］。植物線粒體基因組的大小從200 kb到2 500 kb不等，基因組構型主要有開環(huán)、閉環(huán)、超螺旋、線狀等。植物線粒體基因組包含大約60個基因，分別與電子傳遞鏈、核糖體蛋白、tRNA、核糖體核糖核酸相關，涉及到呼吸作用、能量傳遞等方面［20-21］。進一步對植物線粒體的蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，線粒體包含了超過1 000種蛋白，遠遠超過其自身的基因數(shù)目，其中大部分蛋白是由細胞核基因所編碼，說明線粒體基因在行使其功能的同時，與核基因組存在著復雜的相互作用［21］。Levings等［22］首次證明了玉米 T 型細胞雄性不育系和正常胞質的線粒體基因組之間的不同，提出線粒體DNA的重組是導致不育表型的的原因。進一步的研究驗證了植物線粒體DNA 的變異與CMS 相關，即線粒體基因組的變異、重組、特異的線粒體基因表達、線粒體基因重排等會導致植物出現(xiàn)雄性不育的表型［23-24］。

迄今為止，研究者已經在13種作物上發(fā)現(xiàn)了28個細胞質雄性不育相關基因［16］。這些不育基因主要來源是線粒體基因組內保守基因或非編碼RNA的自我重排后產生的新的嵌合基因。這類重組后的orf或產生毒性蛋白危害細胞、或干擾線粒體正常功能引起線粒體能量代謝紊亂，造成絨氈層細胞異常凋亡，中斷小孢子體的發(fā)育，從而導致植物的雄性不育［16］。

3 主要作物上發(fā)現(xiàn)的細胞質雄性不育基因

3.1 玉米CMS不育基因

玉米是世界上重要的糧食、經濟、飼料、深加工農作物，同時也是最早利用細胞質雄性不育進行雜交種生產的作物之一。玉米的細胞質雄性不育主要分為CMS-T、CMS-S、CMS-C 3種主要類型。其中T 和C 型屬于孢子體不育類型，敗育徹底，敗育發(fā)生在花粉小孢子形成過程中；S 型屬于配子體不育類型，育性不穩(wěn)定，敗育發(fā)生在單核花粉期。玉米T型胞質不育相關基因T-urf13編碼一個分子量為13 kDa的蛋白，命名為URF13，是玉米中第一個被發(fā)現(xiàn)的不育相關蛋白［25］。研究表明，通過刪除或移碼改變和影響urf13基因的表達能夠使T 型不育系的不育表型得到恢復，明確了該基因與CMS-T的相關性［26］。URF13定位在線粒體內膜上，推測其在T 型不育系中的表達可能影響了線粒體內膜的通透性，導致電子傳遞與化學梯度的紊亂，進而引起花粉敗育［27］。隨后研究發(fā)現(xiàn)URF13在玉米各個組織中普遍存在，為組成型表達的模式，但其蛋白只在玉米T型不育系的花藥中才產生毒性，可能存在某些特異的蛋白因子誘導了其在花藥中特異毒性的產生。在有CMS-T類型的核恢復基因存在時，urf13的轉錄水平受到抑制，蛋白的表達豐度下降，不育的表型被抑制，育性得到恢復［28］。在玉米S型的細胞質雄性不育中發(fā)現(xiàn)一個R區(qū)域與其不育的表型存在聯(lián)系。R區(qū)域內有兩個重組后的線粒體嵌合基因orf335和orf77，在恢復基因RF3存在的情況下，該轉錄本被剪切并降解，從而使不育系的育性得以到恢復［29］。玉米C型細胞質雄性不育中與不育表型相關的基因可能與來源于線粒體atp9、coxII的重組嵌合基因atp6c相關，但目前并未得到進一步的證實［30］。

3.2 水稻CMS不育基因

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的糧食作物，其產量的穩(wěn)定與提高直接關系到全世界的口糧安全。雜交水稻的大面積生產正是發(fā)掘和利用了水稻的細胞質雄性不育材料。我國水稻中目前發(fā)現(xiàn)的CMS依據(jù)不育細胞質的來源不同主要分為5類：包臺型細胞質雄性不育（BT-CMS），紅蓮型細胞質雄性不育（HL-CMS），野生敗育細胞質雄性不育（WA-CMS），Lead型細胞質雄性不育（LD-CMS），中國野生稻型細胞質雄性不育（CW-CMS）。目前生產上利用較多的為前3種類型。水稻不育基因的生產應用一直優(yōu)先于分子生物學機制的研究，但隨著第一個水稻線粒體基因組測序完成，水稻不育基因的研究得到了進一步發(fā)展［31］。野敗型細胞質雄性不育（WA-CMS）是被最早發(fā)現(xiàn)與利用的一類不育胞質類型，也是推廣面積與影響最大的一類不育胞質類型。1970年，袁隆平課題組在海南三亞南紅農場發(fā)現(xiàn)了細胞質雄性不育野生稻，自此雜交水稻的生產發(fā)生了巨大變化。以野生敗育材料為基礎，成功選育了野敗型細胞質雄性不育的保持系和不育系，打破了“自花授粉作物無法利用雜種優(yōu)勢”的束縛，使三系雜交稻得以推廣利用，為世界的糧食生產作出了巨大的貢獻［4］。人們在利用CMS-WA于雜交稻育種的同時，也對其分子生物學機制進行了不斷的研究。根據(jù)已測序的水稻線粒體基因組，把水稻線粒體490 kb的基因組分成43個片段，每個片段特異的引物進行PCR擴增，并以這些擴增片段作為覆蓋了全部線粒體基因組的43個片段的探針，對野敗型細胞質雄性不育系、保持系及恢復系進行大量Northern blotting分析，對差異結果進行測序、比對與分析后發(fā)現(xiàn)不育系中存在一條特異的轉錄本［4］。對轉錄本進一步分析發(fā)現(xiàn)其由多個功能未知的線粒體片段重組后而產生的一個嵌合基因，編碼352個氨基酸，位于線粒體rpl5基因的下游，是一個具有3個跨膜區(qū)的跨膜蛋白，實驗證明這些跨膜區(qū)是其蛋白對大腸桿菌產生毒性的必須結構［5］。通過遺傳轉化含靶向線粒體信號肽的載體實驗顯示，該基因是導致CMS-WA不育表型的關鍵基因，并命名為WA352［5］。Wa352與玉米的T-urf13表達模式相似，為一個組成型表達基因，但是WA352蛋白特異性的在花粉母細胞期的花藥絨氈層積累。以WA352為誘餌蛋白進行酵母雙雜交篩選酵母文庫，發(fā)現(xiàn)COX11（核基因編碼的線粒體細胞色素c氧化酶的一個亞基）是WA352的互作蛋白，研究證明COX11不但與呼吸鏈的能量代謝有關還有清除細胞內活性氧的功能。WA352 蛋白在花粉母細胞期的絨氈層特異積累后與COX11 互作，兩者結合后抑制COX11清除活性氧的功能，進而引起了絨氈層活性氧的爆發(fā)和細胞色素c從線粒體的釋放。這些刺激信號誘發(fā)絨氈層過早的發(fā)生細胞程序性死亡，影響花粉正常發(fā)育，導致花粉敗育而產生不育的表型［5］。水稻CMS-HL與CMS-BT的不育基因都與線粒體嵌合基因atp6-orf79轉錄本相關，其序列相似性達到98%。當ORFH79表達時，ATP與NADH的水平下降。在線粒體內，ORFH79與核編碼的線粒體電子傳遞鏈復合物3的亞基P61互作，降低了復合物3的活性，導致ATP產量的下降而引起不育的表型［45-46］。

3.3 油菜CMS 不育基因

油菜是我國重要的油料作物同時也是重要的深加工作物，在國民經濟生活中具有重要地位。目前油菜中的細胞質雄性不育應用較多的主 要 有 CMS-pol、CMs-nap、CMS-ogu 3種 類型［32］。波里馬細胞質雄性不育（CMS-pol）是華中農業(yè)大學傅廷棟教授于1972年發(fā)現(xiàn)，這類不育系的典型特點就是在不同核背景下育性容易受溫度的影響而產生育性的變化，因此CMS- pol的不育系又被分成低溫不育、高溫不育和穩(wěn)定不育3種類型［33］。研究發(fā)現(xiàn)CMS-pol胞質的雄性不育基因為一個線粒體開放閱讀框orf244與線粒體基因atp6的嵌合復合物，即orf224-atp6；在線粒體基因組上orf224位于atp6的上游，與atp6基因共轉錄［34］。CMS-nap胞質也是在1972年發(fā)現(xiàn)的，但在生產上沒有被大面積推廣利用，其主要原因一是此類胞質不育材料對溫度十分敏感，育性不穩(wěn)定；二是該型胞質不育材料的保持系少，僅有Bronowski能夠保持CMS- nap 的不育表型。CMS- nap胞質的不育基因為orf222，與CMS-pol類型的不育基因orf224高度同源，兩者編碼的蛋白序列相似性高達到79%。不育基因orf222與線粒體基因nad5c以及orf139共轉錄，造成不育的表型［35］。CMS-ogu是首先在蘿卜中發(fā)現(xiàn)然后導入到油菜的一種不育胞質，CMS-ogu的不育相關基因為orf138，編碼一個大小約20 kDa的蛋白，并在線粒體內膜上形成一個大小約750 kDa的蛋白復合體，該蛋白是一種毒蛋白，可抑制大腸桿菌的生長［36］。

3.4 蘿卜CMS不育基因

目前蘿卜上發(fā)現(xiàn)的不育胞質類型主要有CMS-Don與CMS-Kos兩種類型。兩種類型胞質的不育基因同樣是線粒體基因組重組產生的。CMS-Kos型的不育基因為orf125-atp8，與油菜CMS-ogu的不育基因orf138是同源基因，其基因序列與orf138相比，在編碼區(qū)只存在兩個氨基酸的替換與一段39 bp的缺失。與多個不育基因相似，orf125-atp8編碼一個跨膜蛋白，對大腸桿菌具有毒性［37］。通過比較不育胞質與正常胞質整個線粒體基因組序列發(fā)現(xiàn)CMS-Don型的不育相關基因是orf463，編碼含有12個跨膜域跨膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)同樣對大腸桿菌有毒［38］。

3.5 向日葵CMS不育基因

向日葵中不育相關基因為atp1-orf522，是由于線粒體基因組在atp1位點重組過程中產生了一個1 kb 倒位與一個5 kb 的插入造成的。重組的結果是形成新編碼區(qū)orf522，orf522與atpA基因編碼一個大小約為15 kDa有毒性的膜蛋白，導致不育的表型［39］。

3.6 其他作物的CMS不育基因

小麥CMS-AP型的不育相關基因是orf256，位于線粒體基因cox1的上游，編碼一個大小約7 kDa的蛋白，可能是影響了線粒體膜的功能而產生不育表型［40］；菜豆的不育相關基因是一個重組后的嵌合基因atp1-orf98-orf239，編碼一個大小約27 kDa的蛋白［41］；辣椒CMSPeterson型的不育相關基因有cox2-orf456 與cox2-orf507，分別編碼大小約為17 kDa與19.5 kDa的蛋白，決定著不育的表型［42-43］。

綜上所述，相比水稻不育基因WA352，其他作物上關于不育基因的研究還不是很深入。通過對比不育胞質與正常胞質的DNA、RNA及蛋白找到一些差異，并定義和確定了與不育相關的一些基因，但這些相關不育基因的功能與導致花粉敗育的機制還需要進一步的探索與研究［4］。目前已知的不育基因均與線粒體相關。線粒體基因組自身重組，或與核基因組發(fā)生重組后產生新的開放閱讀框，新的閱讀框編碼的蛋白可導致細胞毒性的產生，從而引起線粒體膜系統(tǒng)的運輸、代謝與功能的紊亂而殺死細胞，導致花粉生長異常或不萌發(fā)，最終導致敗育的產生［44］。

4 細胞質雄性不育基因的相同點

4.1 細胞質雄性不育基因的來源相似性

目前發(fā)現(xiàn)的不育基因來源于線粒體基因組的重組，一般會與線粒體呼吸鏈的基因嵌合或重排，最終形成一個共轉錄的orf或單個有毒的orf。目前所鑒定的CMS不育基因多通過比較不育系與保持系之間線粒體基因（組）在基因組、轉錄組和蛋白組之間的差異最終確定為CMS基因。例如，水稻CMS-WA的不育基因WA352的發(fā)現(xiàn)就是通過野敗型不育系、保持系、恢復系進行Northern blotting分析，通過整個基因組的比對而發(fā)現(xiàn)的；玉米CMS-T型細胞質雄性不育蛋白URF13是從蛋白水平通過比較CMS與可育材料間蛋白質組差異來確認的［44］；水稻中CMS-HL中的ORFH79與CMS-BT中的ORF79為同源基因，且同源性很高，兩者有相同的不育機制［46］；高粱上CMS-A3的ORF107的N端31個氨基酸與ATP9 N端存在84%的相似性，C端49個氨基酸與水稻ORF79 C端具有80%的相似性［47］；其他已經確認的CMS基因如蘿卜里的CMS-Kos型的orf125和蕓薹屬植物里的CMS-Ogu型的orf138僅在編碼區(qū)有兩個氨基酸的替換與一個39 bp的缺失［37］；甜菜CMS-G型中突變了的cox2引發(fā)不育表型，基因序列來自于線粒體基因［38］。

4.2 細胞質雄性不育基因的蛋白功能相似性

多數(shù)的不育系基因編碼大小約為10～35 kDa的跨膜蛋白，至少包含有一個疏水區(qū)域。這些跨膜蛋白可以融合到線粒體內膜，破壞質子梯度從而影響能量的合成，導致敗育的產生。即細胞質雄性不育基因的蛋白影響了花藥細胞中線粒體的正常功能導致了植物孢子體或胚子體的雄性敗育［16］，如玉米中的CMS-T型的URF13是第一個被發(fā)現(xiàn)的CMS蛋白，研究顯示URF13蛋白不但對大腸桿菌有毒且對另外的真核細胞也具有毒害作用。自玉米T-URF13后陸續(xù)報道的CMS蛋白，包括向日葵CMS-PET1的ORF522［39］，蘿卜CMS-Ogu的ORF138［37］，蕓薹屬植物CMS-Hau的ORF288［49］，水稻CMS-BT的ORF79都對大腸桿菌具有毒性作用［47］。水稻中CMS-WA的WA352同樣是一種毒性蛋白，對大腸桿菌的轉化結果顯示有一定程度的毒性［44］。

5 細胞質雄性不育的研究展望

現(xiàn)代分子生物學技術革命日新月異，新技術正越來越大的影響著傳統(tǒng)育種并推進著作物育種科學向前發(fā)展。新技術、新方法如基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組、表觀基因組、表形組等多水平的全面整合，可加快CMS機理研究。利用這些新技術，發(fā)現(xiàn)并鑒定多個細胞質雄性不育不育相關基因，進行了初步的分子生物學功能分析。這些研究對于理解CMS的功能機制提供了一些分子基礎。然而對于大多數(shù)的CMS系統(tǒng)，CMS蛋白的作用機理是怎樣產生不育的表型，以及是如何與CMS的恢復蛋白發(fā)生作用任然不清楚［4］。盡管水稻CMS-WA的不育基因經過大量的科學研究已揭示其功能機制，但在其他主要糧食作物如小麥、高粱、玉米等的研究則一直比較緩慢，它們的不育機理是否和水稻相同或相似還需要科研工作者付出更多的努力。目前細胞質雄性不育不育機制的理論認識仍然落后于其生產應用。CMS的利用與雜種優(yōu)勢的利用緊密相連，盡早闡述CMS的功能及不育機理有利于促進雜種優(yōu)勢的利用，提高作物產量，推動糧食安全生產起著巨大推動作用［16］。