王茂輝 ，鐘春燕 ，羅文龍 ，聶金泉 ，郭 濤 ，王 慧 ，陳志強(qiáng)

（1.肇慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 肇慶 526000；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

基因定位主要是基于染色體重組進(jìn)行連鎖分析來(lái)定位目標(biāo)基因，即確定基因在染色體上的位置。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的成熟和廣泛應(yīng)用，是近30年來(lái)基因定位能夠得到快速發(fā)展的技術(shù)基礎(chǔ)，一般以基因組少量分子標(biāo)記進(jìn)行的基因定位，需要經(jīng)過(guò)初步定位和精細(xì)定位兩個(gè)階段。分離群體分組分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）［1］是快速對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行初步定定位的常用方法，在此基礎(chǔ)上利用連鎖標(biāo)記分析隱性單株，就能進(jìn)一步精細(xì)定位目標(biāo)基因。BSA與多種分子標(biāo)記可以相結(jié)合用于基因定位，常用的分子標(biāo)記有簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats, SSR）、插入/缺失（Insertion-Deletion, InDel）等［2］。SSR 標(biāo)記是由2～5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，由于SSR位點(diǎn)兩側(cè)的堿基順序高度保守，因此可以利用某個(gè)兩端保守的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，即SSR標(biāo)記。相對(duì)另一個(gè)親本而言，其中一個(gè)親本的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失，根據(jù)這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物就稱為InDel標(biāo)記。

第一代測(cè)序技術(shù)的標(biāo)志是1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法［3-4］，雖然Sanger測(cè)序法是直接有效的檢測(cè)基因突變狀態(tài)的方法，但也存在一定的不足，如檢測(cè)基因突變的敏感性較低、實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間長(zhǎng)、易產(chǎn)生污染等。第二代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing, NGS）相對(duì)于以Sanger測(cè)序法為代表的第一代測(cè)序技術(shù)而得名。與Sanger測(cè)序相比新一代測(cè)序技術(shù)共有的突出特征是單次運(yùn)行產(chǎn)出的序列數(shù)據(jù)量很大，故而又被通稱為高通量測(cè)序技術(shù)［5］，Illumina測(cè)序平臺(tái)是高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)中通量最高。高通量測(cè)序技術(shù)能快速地一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序［6］。第三代測(cè)序技術(shù)是在第二代基礎(chǔ)上增加讀長(zhǎng)、降低成本，并且加快運(yùn)行速度，其顯著特點(diǎn)是單分子測(cè)序（Single molecule sequencing，SMRT）［7］。 與Sanger測(cè)序法和NGS測(cè)序技術(shù)相比，SMRT測(cè)序具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、測(cè)序周期短、無(wú)需模板擴(kuò)增和直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)等特點(diǎn)，為研究人員提供了新選擇。高通量測(cè)序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)模基因組測(cè)序，大大降低了單堿基測(cè)序費(fèi)用，也給基因組學(xué)研究帶來(lái)了更多的新契機(jī)。目前高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組重測(cè)序、小RNAs測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表觀基因組測(cè)序等方面［8］。利用極端性狀個(gè)體混合池進(jìn)行目標(biāo)性狀基因定位是一種快捷基因定位方法，隨著測(cè)序技術(shù)的革新進(jìn)步，高通量測(cè)序技術(shù)越來(lái)越多地運(yùn)用到了基因定位，例如利用BSA與高通量測(cè)序結(jié)合的BSA-seq（BSA by sequencing）基因定位，并基于BSA分析法開發(fā)出了一系列新技術(shù)，如MutMap［9］、QTL-seq和MutMap-Gap［10］等。本質(zhì)上，BSA-seq是利用基因組全局的大量分子標(biāo)記（幾萬(wàn)個(gè)以上）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而快速地進(jìn)行目標(biāo)基因定位。

已發(fā)現(xiàn)的水稻斑點(diǎn)葉突變體中，大多能提高對(duì)稻瘟病及白葉枯病等的抗性并激發(fā)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)掘新的水稻斑點(diǎn)葉突變體對(duì)增強(qiáng)植株抗病性及對(duì)抗病反應(yīng)的認(rèn)知具有重要的意義。目前報(bào)道的水稻斑點(diǎn)葉突變體大多是由于細(xì)胞死亡引起的，在第7號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)斑點(diǎn)葉突變體基因，分別為CRK10［11］和SPL32［12］，兩個(gè)突變體也均出現(xiàn)細(xì)胞死亡及早衰現(xiàn)象，而由色素積累導(dǎo)致的斑點(diǎn)葉突變體還少有報(bào)道，Spl30突變體出現(xiàn)的紅棕色斑點(diǎn)并非是由細(xì)胞死亡引起［13］。這一系列關(guān)于水稻斑點(diǎn)葉突變體被發(fā)掘說(shuō)明了關(guān)于水稻斑點(diǎn)葉突變體研究的重要性，同時(shí)相關(guān)斑點(diǎn)葉突變體大多涉及細(xì)胞死亡以及突變體出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，而本研究材料Spl34卻未出現(xiàn)細(xì)胞死亡和植株早衰。突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料，近年來(lái)利用水稻突變體進(jìn)行水稻功能基因組學(xué)研究取得重大進(jìn)展［14-15］。發(fā)掘和鑒定各式各樣的水稻斑點(diǎn)葉突變體，不僅有助于對(duì)水稻品種改良和抗病性研究，同時(shí)水稻抗病種質(zhì)資源的挖掘和研究，對(duì)于闡明水稻抗病機(jī)制、培育抗病新品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻斑點(diǎn)葉突變體Spl34是從正常綠葉品種粵晶絲苗2號(hào)和H4的F2群體中獲得的自然突變體，連續(xù)多代種植后其突變表型穩(wěn)定遺傳。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究利用粳稻Francis與Spl34雜交的F2代構(gòu)建遺傳分析和斑點(diǎn)葉基因Spl34（t）精細(xì)定位的群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 遺傳分析及群體構(gòu)建 試驗(yàn)材料種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)基地，在2014年晚季以Francis為母本、Spl34為父本，配制雜交組合獲得相應(yīng)F1種子。2015年早季種植F1，2015年晚季種植F2，利用F2分離群體進(jìn)行斑點(diǎn)葉性狀的遺傳學(xué)分析，以F2（Francis/Spl34）群體作為斑點(diǎn)葉基因精細(xì)定位群體。成熟期分別調(diào)查父母本、F1和F2群體各個(gè)單株的葉上斑點(diǎn)情況，根據(jù)斑點(diǎn)有無(wú)分為斑點(diǎn)葉和正常綠葉兩組，統(tǒng)計(jì)兩組的植株數(shù)，計(jì)算分離比例并進(jìn)行卡平方測(cè)驗(yàn)。

1.2.2 基于SSR/InDel標(biāo)記的基因定位 通過(guò)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)航天育種工程技術(shù)中心現(xiàn)有的SSR標(biāo)記進(jìn)行親本多態(tài)性分析及群體分析，在初定位區(qū)間內(nèi)通過(guò)Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)日本晴（粳稻）和9311（秈稻）的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，從中篩選InDel位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，利用初步定位得到的兩個(gè)連鎖標(biāo)記InDel-23和InDel-30分析F2（Spl34/Francis）中的無(wú)斑點(diǎn)隱性個(gè)體，篩選帶型為雜合的重組子。利用開發(fā)的新標(biāo)記，對(duì)獲得的重組子進(jìn)行篩選，進(jìn)一步保留其中的雜合個(gè)體，通過(guò)不斷重復(fù)新標(biāo)記篩選交換株，逐步將定位區(qū)間縮小。通過(guò)水稻基因組在線注釋系統(tǒng)RiceGAAS對(duì)精細(xì)定位區(qū)域的基因組序列進(jìn)行基因注釋和功能預(yù)測(cè)。

1.2.3 基于BSA-seq法的基因定位 混合池測(cè)序從F2群體（Francis×Spl34）中，隨機(jī)選擇20個(gè)完全沒有斑點(diǎn)的個(gè)體，取等量葉片混合提取DNA，作為隱性基因極端池；隨機(jī)選擇20個(gè)斑點(diǎn)葉性狀明顯的個(gè)體，取等量葉片混合提取DNA，作為顯性基因極端池。將極端池的高質(zhì)量基因組DNA，依次進(jìn)行DNA片段化、片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測(cè)序接頭、片段大小選擇，最終進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)（雙末端125 bp）；建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)利用Illumina HiSeq2500進(jìn)行測(cè)序。兩個(gè)DNA池及兩親本測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)檢測(cè)確認(rèn)質(zhì)量達(dá)到要求后比對(duì)到日本晴基因組（IRGSP-1.0），進(jìn)一步檢測(cè)SNP并計(jì)算兩個(gè)池SNP的等位基因頻率（Allele Frequency, AF）［16］。分析測(cè)序數(shù)據(jù)獲得候選SNP，通過(guò)歐氏距離法（Euclidean distance,ED）關(guān)聯(lián)分析連鎖關(guān)系，確定候選基因在染色體上的區(qū)域。通過(guò)水稻基因組在線注釋系統(tǒng)RiceGAAS對(duì)定位區(qū)域的基因組序列進(jìn)行基因注釋和功能預(yù)測(cè)，對(duì)可能的候選基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，比較其在Spl34、分離無(wú)斑植株和Francis的序列差異。為了更直觀的比較定位區(qū)間內(nèi)的序列差異，將利用IGV（Integrative genomics viewer）對(duì)比對(duì)的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，以便于篩選可能的突變基因［17］。

1.2.4 突變體Spl34的單分子測(cè)序及數(shù)據(jù)分析將突變體Spl34提取高質(zhì)量的基因組DNA，片段化后構(gòu)建大片段文庫(kù)（10 kb），利用PacBio RSⅡ進(jìn)行SMRT測(cè)序，原始數(shù)據(jù)覆蓋度15倍以上。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并利用Illumina測(cè)序產(chǎn)生的短片段進(jìn)行堿基校正［18］。校正后的單分子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，生成基因組重疊群（Contigs）。以Spl34基因組一致性序列為參考，將F2混合池的測(cè)序數(shù)據(jù)按相同方法進(jìn)行比對(duì)、SNP檢測(cè)和關(guān)聯(lián)分析，以確定候選基因在Spl34基因組的定位區(qū)域。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，通過(guò)Sanger測(cè)序比較Spl34和對(duì)照的序列差異，并對(duì)Spl34和日本晴定位區(qū)間序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于SSR/InDel標(biāo)記的基因定位

2.1.1 遺傳分析及定位群體構(gòu)建 調(diào)查Francis/Spl34群體的F1植株表型，發(fā)現(xiàn)F1群體植株都表現(xiàn)為斑點(diǎn)葉，說(shuō)明突變體斑點(diǎn)葉性狀受顯性基因控制。F2群體植株出現(xiàn)明顯的表型分離，分別表現(xiàn)親本的性狀，沒有中間類型的植株。隨機(jī)選取Francis/Spl34的F2群體單株共150株，調(diào)查發(fā)現(xiàn)其中斑點(diǎn)葉植株為114株，正常綠葉植株為36株，經(jīng)卡平方測(cè)驗(yàn)斑點(diǎn)葉與正常綠葉個(gè)體的分離比符合3∶1分離比（χ2=0.436＜χ20.05,1=3.840），說(shuō)明該斑點(diǎn)葉性狀受1個(gè)顯性核基因控制。

2.1.2 基于SSR/InDel的斑點(diǎn)葉基因Spl34（t）精細(xì)定位 本研究利用Francis×Spl34雜交的F2群體為定位群體，選取350個(gè)F2隱性單株（即正常葉表型）進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位研究。利用現(xiàn)有的第11號(hào)染色體上的31對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)親本Francis和Spl34進(jìn)行多態(tài)性分析，其中有多態(tài)性的SSR標(biāo)記10對(duì)，多態(tài)率為32.25%。利用BSA對(duì)這10對(duì)標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)RM206、RM187和RM254與目標(biāo)基因存在連鎖關(guān)系，繼續(xù)在標(biāo)記RM206和RM254之間進(jìn)一步開發(fā)InDel分子標(biāo)記共33個(gè)，其中6個(gè)有多態(tài)性。利用RM206、RM187、RM254以及6個(gè)InDel標(biāo)記對(duì)350個(gè)正常綠葉的F2單株進(jìn)行分析，結(jié)果標(biāo)記InDel-19、InDel-23和InDel-30的交換率分別為5.2%、3.3%、10.0%，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離，因此將Spl34（t）基因定位在InDel-23標(biāo)記附近，遺傳距離為3.30 cM（圖1A）。InDel-19與InDel-30標(biāo)記的區(qū)間內(nèi)無(wú)法繼續(xù)開發(fā)InDel標(biāo)記，因此轉(zhuǎn)而開發(fā)SSR標(biāo)記，共找到30個(gè)SSR標(biāo)記，其中6個(gè)多態(tài)性標(biāo)記分別為SSR-12、SSR-15、SSR-17、SSR-21、SSR-22和 SSR-30。通過(guò)對(duì)350個(gè)正常綠葉的F2單株進(jìn)行分析，最終將Spl34（t）基因定位在標(biāo)記SSR-15與標(biāo)記SSR-21之間的46.99 kb區(qū)間，與SSR-17標(biāo)記遺傳距離為1.71 cM（圖1B）。

圖1 基于SSR/InDel法斑點(diǎn)葉基因Spl34（t）精細(xì)定位

2.1.3 定位區(qū)間候選基因分析 通過(guò)精細(xì)定位分析最終將斑點(diǎn)葉基因Spl34（t）定位在SSR-15與SSR-21之間的46.99 kb，通過(guò)在線系統(tǒng)RiceGAAS對(duì)精細(xì)定位區(qū)域篩選候選基因，共篩選到8個(gè)候選基因（圖1C），對(duì)8個(gè)候選基因進(jìn)行基因注釋及功能預(yù)測(cè)（表1）。

2.2 基于高通量測(cè)序進(jìn)行BSA-seq的基因定位

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和關(guān)聯(lián)分析 對(duì)兩個(gè)具有極端表型差異的親本構(gòu)建株系，對(duì)子代具有極端表型差異的兩個(gè)樣本池進(jìn)行等量混合池和全基因組重測(cè)序，同時(shí)對(duì)親本進(jìn)行測(cè)序，利用BSA法快速有效地尋找與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)并進(jìn)行注釋。通過(guò)BSA-seq對(duì)8個(gè)水稻建庫(kù)重測(cè)序及2個(gè)親本進(jìn)行DNA-BSA測(cè)序分析，測(cè)序數(shù)據(jù)量結(jié)果見表2。

表1 候選基因及其功能注釋

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)量匯總

以日本晴為參考序列，將親本及F2混合池測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)和變異檢測(cè)，并利用ED法分析關(guān)聯(lián)的SNP。在ED法關(guān)聯(lián)分析前，先對(duì)SNP進(jìn)行過(guò)濾，首先過(guò)濾任一混合池中讀取數(shù)支持度小于4的位點(diǎn)，得到高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)共2 234 370個(gè)，并在此基礎(chǔ)上識(shí)別兩混池間差異的位點(diǎn)共1 754 438個(gè)。利用ED方法計(jì)算關(guān)聯(lián)值，并取原始ED的5次方作為關(guān)聯(lián)值以達(dá)到消除背景噪音的功能，然后采用DISTANCE方法對(duì)ED值進(jìn)行擬合，由關(guān)聯(lián)值分布可以看出，第11號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)關(guān)聯(lián)效果很好，說(shuō)明基因定位在第11號(hào)染色體（圖2，封二）。

根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值判定，定位區(qū)域?qū)?yīng)到日本晴基因組坐標(biāo)為chr11：23 223 211～ 23 791 314，區(qū)間大小約568 kb，包含101個(gè)轉(zhuǎn)錄本（表3）。該定位區(qū)間與基于SSR/InDel標(biāo)記的定位區(qū)間部分重疊。但是，由于定位區(qū)間內(nèi)突變體的序列與日本晴基因組差異很大，無(wú)法與日本晴進(jìn)行有效比對(duì)，導(dǎo)致混合池SNP等位基因頻率與隱性親本Francis完全一致，因而定位區(qū)間無(wú)法進(jìn)一步縮小，由圖3（封二）比對(duì)到日本晴坐標(biāo)為 chr：23.43～23.50 Mb。

表3 關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)

2.2.2 基于單分子測(cè)序從頭組裝序列的關(guān)聯(lián)分析 為了進(jìn)一步縮小基因Spl34（t）的定位區(qū)間，將突變體進(jìn)行單分子測(cè)序和從頭組裝，并將得到的重疊群為參考進(jìn)行混合池測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)、SNP檢測(cè)和ED關(guān)聯(lián)分析。單分子測(cè)序產(chǎn)生數(shù)據(jù)量為8.54 Gb，進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾后堿基總量8.29 Gb。對(duì)SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，產(chǎn)生4 290個(gè)大于10 kb的重疊群，平均長(zhǎng)度61.97 kb，累加總長(zhǎng)度達(dá)到265.86 Mb。將F2混合池的測(cè)序數(shù)據(jù)按相同方法進(jìn)行比對(duì)、SNP檢測(cè)和關(guān)聯(lián)分析，最終在兩個(gè)重疊群tig00001409和tig00003011檢測(cè)到緊密連鎖。進(jìn)一步將兩個(gè)重疊群的局部序列在日本晴基因組上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重疊群分別與日本晴chr11:23.46～23.51 Mb兩側(cè)序列高度一致（表4）。兩個(gè)重疊群長(zhǎng)度分別為134.35 kb和92.00 kb，設(shè)計(jì)引物對(duì)Spl34進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，測(cè)得兩個(gè)重疊群之間的間隔（gap）長(zhǎng)度7.6 kb。最終，相連的新重疊群序列總長(zhǎng)達(dá)到233.95 kb，其中Spl34（t）定位區(qū)間位于新重疊群區(qū)間，大小約為40 kb（圖4）。

表4 Spl34重疊群局部序列在日本晴基因組的Blast分析結(jié)果

2.2.3 定位區(qū)間內(nèi)序列比較分析 基于在線Multalin（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）多重序列比對(duì)軟件，對(duì)利用tig00003011末端和tig00001409前端序列為模板擴(kuò)增的兩個(gè)重疊群之間7.6 kb區(qū)間，比較突變體Spl34和對(duì)照在7.6 kb區(qū)間序列差異，發(fā)現(xiàn)兩者沒有差異。重疊群tig00003011尾部和重疊群tig00001409前部大小分別為16 989、15 400 bp。根據(jù)SMRT測(cè)序獲得的重疊群序列分別設(shè)計(jì)11和10對(duì)引物后，PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果顯示，大部分?jǐn)U增的突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)對(duì)照均可擴(kuò)增出目的片段，而日本晴無(wú)法擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明日本晴可能存在雜合及非特異擴(kuò)增現(xiàn)象（圖5）。該結(jié)果與Spl34重疊群局部序列在日本晴基因組的分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

圖4 新重疊群在日本晴的基因組坐標(biāo)

圖5 重疊群tig00003011和tig00001409擴(kuò)增瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果

本研究遺傳分析表明，突變體Spl34的斑點(diǎn)葉表型受單個(gè)顯性基因Spl34（t）調(diào)控，利用Francis×Spl34雜交的F2群體為定位群體，SSR/InDel標(biāo)記對(duì)無(wú)斑點(diǎn)葉隱性單株進(jìn)行連鎖分析將斑點(diǎn)葉基因Spl34（t）定位到第11號(hào)染色體，定位區(qū)間為46.99 kb，并篩選到8個(gè)候選基因。在利用SSR/InDel標(biāo)記對(duì)進(jìn)行精細(xì)定位的同時(shí)，還通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行BSA-seq分析，以確保能夠精細(xì)定位基因Spl34（t）。高通量測(cè)序經(jīng)過(guò)DNA-BSA、SNP過(guò)濾、混池間差異識(shí)別、ED值關(guān)聯(lián)分析，最后將基因定位在第11號(hào)染色體，區(qū)間大小約568 kb。為了能夠達(dá)到精細(xì)定位Spl34（t）的目的，繼續(xù)利用單分子測(cè)序技術(shù)對(duì)Spl34突變體進(jìn)行測(cè)序，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)輔助校正后從頭組裝，累加總長(zhǎng)度達(dá)到265.86 Mb。對(duì)F2混合池的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行BSA關(guān)聯(lián)分析，最終在兩個(gè)重疊群tig00001409和tig00003011檢測(cè)到緊密連鎖。進(jìn)一步對(duì)Spl34進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)得兩個(gè)重疊群之間的間隔長(zhǎng)度7.6 kb，最終Spl34（t）定位區(qū)間約40 kb。

本研究中試驗(yàn)材料與參考序列差異較大，因此較難開發(fā)定位區(qū)間里面的高密度標(biāo)記，很難縮小區(qū)間，通過(guò)InDel和SSR標(biāo)記縮小定位區(qū)間至46.99 kb，但是突變體Spl34變異區(qū)間大小相對(duì)于參考序列可能更小。具有類似的研究報(bào)道也有很多，如斑點(diǎn)葉突變體hm197［19］的褐色斑點(diǎn)基因定位，突變體Spl21［20］的基因定位等。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)則使得區(qū)間定位與候選基因識(shí)別可直接通過(guò)測(cè)序完成［21］。然而由于秈稻品種的遺傳背景較復(fù)雜、差異大等特點(diǎn)，高通量測(cè)序與BSA結(jié)合的BSA-seq在秈稻中的應(yīng)用研究還不是很多。本研究通過(guò)BSA-seq和單分子測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因精細(xì)定位，最終定位區(qū)間大小約為40 kb。關(guān)于此類測(cè)序定位的研究還有很多，如在擬南芥的研究中利用少量F2突變體構(gòu)建混合池測(cè)序，并比較SNP比率差從而獲得候選區(qū)間［22］。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展和測(cè)序成本的不斷降低，越來(lái)越多地利用簡(jiǎn)單快捷的測(cè)序手段對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)定位，例如對(duì)突變體基因組直接測(cè)序定位、構(gòu)建混合池測(cè)序定位以及遺傳分離群體測(cè)序構(gòu)建遺傳圖譜等，還可以對(duì)部分基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序定位［23］。本研究基于高通量測(cè)序?qū)λ景唿c(diǎn)葉基因Spl34（t）進(jìn)行精細(xì)定位，與分子標(biāo)記基因定位相比不僅大大降低了時(shí)間周期，也提高了基因定位的精確度。傳統(tǒng)基因定位分子標(biāo)記的開發(fā)很大程度上依賴于參考序列，本研究中由于突變體Spl34與日本晴序列差異較大導(dǎo)致最后雖然縮短了定位區(qū)間。高通量測(cè)序大大提高了基因定位效率，隨著測(cè)序成本的降低、測(cè)序技術(shù)的發(fā)展會(huì)有越來(lái)越多的基因被發(fā)掘及利用。