宿慶連，易懋升，周曉云，張志勝

（1.廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

石斛是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物的總稱。石斛為多年生草本植物，全世界約有1 500余個(gè)原生種，我國(guó)以云南、廣西、廣東、海南、貴州和臺(tái)灣等省區(qū)為分布中心，已經(jīng)證實(shí)的石斛種類有79種［1］。石斛是極具觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值的典型植物，作為園藝植物，石斛花具香氣、花期長(zhǎng)，花色鮮艷，與蝴蝶蘭、卡特蘭、大花蕙蘭并稱 “四大洋蘭”，具有極高的觀賞價(jià)值；作為藥用植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為石斛具益胃生津、滋陰清熱、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身等功效，現(xiàn)代藥理研究表明石斛還具增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功效，也具有極高的藥用價(jià)值，目前石斛不僅是石斛夜光丸、石斛清胃散、百花散等成藥的主要配伍成分，還是主要高級(jí)保健品的主要原料，不僅在中國(guó)被廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品、食品、化妝品領(lǐng)域，在美國(guó)、韓國(guó)和日本，石斛提取物也被廣泛應(yīng)用于藥品、化妝品領(lǐng)域［2］。

石斛作為傳統(tǒng)名貴中藥材，受資源短缺和市場(chǎng)供應(yīng)影響，中國(guó)藥典（2010 版）僅收載 5 種，即鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、金釵石斛（D.nobile）、流蘇石斛（D.fimbriatum）、美花石斛（D.loddigesii）、束花石斛（D.chrysanthum），但實(shí)際供藥用的石斛屬植物多達(dá)30余種［3］。一直以來(lái)，人們?cè)谑兴幓瘜W(xué)、藥理學(xué)、栽培學(xué)等方面已做了大量的工作并取得了顯著成果［4］，但在石斛新種質(zhì)選育等方面相對(duì)滯后。近年隨著人們生活品質(zhì)的提高和相關(guān)研究的不斷深入，其藥用石斛種質(zhì)和開(kāi)發(fā)利用也越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注。本文通過(guò)分析近幾年有關(guān)藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新的文獻(xiàn)資料，從國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源收集鑒定與評(píng)價(jià)、雜交育種、誘變育種、倍性育種和基因工程育種等方面綜述藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新現(xiàn)狀和研究成果，旨在為深入開(kāi)展藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新工作提供參考。

1 藥用石斛種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)

1.1 可利用藥用石斛種質(zhì)資源的調(diào)查研究

國(guó)內(nèi)石斛原生種是藥用石斛道地種質(zhì)來(lái)源。在我國(guó)，原產(chǎn)石斛原生種有79種（表1），由于過(guò)度開(kāi)采和人為環(huán)境破壞等原因，導(dǎo)致石斛野生種質(zhì)極為匱乏，可利用種質(zhì)多為人工栽培種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)栽培的僅有鐵皮石斛、金釵石斛、流蘇石斛、美花石斛、束花石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、齒瓣石斛等主要栽培種，以及細(xì)莖石斛、細(xì)葉石斛、鉤狀石斛、疊鞘石斛、報(bào)春石斛、球花石斛、密花石斛、玫瑰石斛、杯鞘石斛、大苞鞘石斛、兜唇石斛、晶帽石斛、黑毛石斛、短棒石斛、羅河石斛、重唇石斛、海南石斛、串珠石斛等30余種藥用石斛種［5-6］，大部分石斛原生種仍未加以重視和利用，開(kāi)展藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新，還應(yīng)盡快做好分布中心與主產(chǎn)區(qū)品種調(diào)查，盡可能地豐富現(xiàn)有的可利用的石斛原生資源。

產(chǎn)地不同，石斛藥材的質(zhì)量也不同。諸燕對(duì)從浙江、云南兩省12個(gè)地區(qū)收集到的17個(gè)栽培群體140余份鐵皮石斛資源進(jìn)行多糖、生物堿、金屬元素含量測(cè)定，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的鐵皮石斛總生物堿含量存在顯著差異［7］；李永清、徐旭棟等分別利用ISSR和SCo T證實(shí)鐵皮石斛群體存在豐富的遺傳多樣性［8-9］，張明宇等利用DALP分析也證實(shí)金釵石斛不同居群間存在較高水平的遺傳分化［10］。說(shuō)明在藥用石斛種質(zhì)資源收集利用上，應(yīng)重視同種石斛不同產(chǎn)地的種質(zhì)差異。

石斛有豐富的園藝栽培種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前石斛已選育出上萬(wàn)個(gè)栽培種［11］。為了進(jìn)一步開(kāi)拓春石斛雜交種在藥用方面的潛在價(jià)值，章金輝等比較金釵石斛與雜交種多糖、生物堿、氨基酸和礦質(zhì)元素等含量后認(rèn)為，在莖多糖含量方面，石斛雜交種與野生金釵石斛無(wú)顯著差異，甚至有個(gè)別品種優(yōu)于野生金釵石斛；莖段總生物堿含量方面，Red Cat1雜交種總生物堿含量達(dá)到野生金釵石斛的50%左右，具有替代藥用石斛原生種的開(kāi)發(fā)價(jià)值［12-13］。王再花等比較了栽培品種 Dendrobium Second Love‘Tokimeki’與金釵石斛的多糖免疫活性，結(jié)果相近，同樣認(rèn)為具有良好的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值［14］。據(jù)調(diào)查，觀賞石斛多為金釵石斛、鼓槌石斛、球花石斛、密花石斛等雜交種，拓寬藥用石斛資源的調(diào)查范圍、篩查藥用成分含量較高的園藝品種，也是豐富藥用石斛資源的重要途徑。

表1 分布于國(guó)內(nèi)的石斛原生種［1］

1.2 藥用石斛種質(zhì)資源的收集保存與評(píng)價(jià)

石斛種質(zhì)資源保存和資源圃建設(shè)工作得到充分重視。自2001年生物資源上升為國(guó)家安全戰(zhàn)略資源以來(lái)，北京于2004年依托北京中醫(yī)藥大學(xué)，在貴州黔西南建立國(guó)內(nèi)首個(gè)藥用石斛種質(zhì)資源圃，收集石斛屬植物30多個(gè)種、種質(zhì)資源35份［15］；福建于2012年由三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院從云南和福建收集野生石斛資源31份開(kāi)展創(chuàng)新研究［16］等；浙江2012年前后，以浙江農(nóng)林大學(xué)為代表的科研院所和一些生產(chǎn)企業(yè)針對(duì)鐵皮石斛創(chuàng)新利用收集了浙江、廣西、云南、貴州、江西、湖南、安徽、福建等省份石斛屬物種40余個(gè)，鐵皮石斛種質(zhì)資源300余份，并建立了藥用石斛種質(zhì)資源庫(kù)［17］。廣東也是最早開(kāi)展石斛資源收集和品種選育的重點(diǎn)省份之一，2002年起，廣東名優(yōu)花卉種質(zhì)資源圃、南藥種質(zhì)資源圃等開(kāi)始建設(shè)、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所和作物研究所、廣州花卉研究中心開(kāi)展了藥用石斛的資源收集和品種選育工作，目前廣東省農(nóng)科院環(huán)境園藝研究所已收集石斛屬資源112份，廣州花卉研究中心已收集原生種資源85個(gè)、栽培種64個(gè)，其中包括鐵皮石斛、金釵石斛、流蘇石斛、美花石斛、束花石斛等30多個(gè)具有較高藥用價(jià)值的種質(zhì)資源。

石斛種質(zhì)資源評(píng)價(jià)工作相對(duì)滯后。在藥用石斛資源質(zhì)量評(píng)價(jià)上，目前《中國(guó)藥典》僅對(duì)資源豐富、產(chǎn)量較大的種如鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛等的指標(biāo)性成分加以控制，對(duì)其他種石斛尚無(wú)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在種質(zhì)資源選育利用評(píng)價(jià)上，斯金平等從多糖、生物堿、氨基酸、金屬元素含量等質(zhì)量性狀以及抗寒性、抗病蟲(chóng)害能力、萌蘗能力、外觀等農(nóng)藝性狀方面對(duì)鐵皮石斛差異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)一批多糖含量、抗寒性、萌蘗性、生長(zhǎng)速度等特異的鐵皮石斛種質(zhì)［17］。張鵬博等從莖稈顏色、莖長(zhǎng)、莖粗、莖節(jié)數(shù)、葉面積等主要表型性狀和石斛多糖含量方面，對(duì)80份野生鐵皮石斛資源開(kāi)展收集評(píng)價(jià)［18］。從目前種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用情況來(lái)看，藥用石斛種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用僅限于鐵皮石斛等少數(shù)種。

2 藥用石斛育種方法

2.1 雜交育種

雜交育種是目前藥用石斛品種創(chuàng)新和種質(zhì)改良的主要手段。在雜交育種技術(shù)研究上，羅煥明等選用鼓槌石斛、兜唇石斛、鐵皮石斛、金釵石斛、報(bào)春石斛和翅梗石斛進(jìn)行自花授粉、同株異花授粉、異株授粉和自然授粉的結(jié)果表明，人工異株授粉能大大提高石斛屬植物的結(jié)實(shí)率，鐵皮石斛自花授粉的結(jié)實(shí)率以開(kāi)花第2～3 d結(jié)實(shí)率最高可達(dá)36.7%［19］；潘春香等測(cè)定了玫瑰石斛、鼓槌石斛、細(xì)莖石斛和金釵石斛4種藥用石斛種間親和力，結(jié)果表明4種石斛種間親和力較高，不存在遠(yuǎn)緣雜交不育性，花期授粉成功率較高［20］；李振堅(jiān)等以晶帽石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、大苞鞘石斛、杯鞘石斛、齒瓣石斛等6個(gè)石斛蘭原種為親本進(jìn)行自交，結(jié)果多數(shù)株間自交結(jié)實(shí)率高于株內(nèi)自交，株間自交鼓槌石斛和兜唇石斛授粉結(jié)實(shí)率＞80%，株內(nèi)大苞鞘石斛的自交親和力高、晶帽石斛的自交親和力低［21］。朱勝蕾按Schlechter分組把石斛分成 12個(gè)“組”中，通過(guò)檢索英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)（RHS）中蘭花登錄情況分析認(rèn)為模式組、黑毛組組內(nèi)雜交更易產(chǎn)生后代，短花組、燈籠組、心葉組、寡花組、鳥(niǎo)腳組組間雜交更易產(chǎn)生后代，優(yōu)秀石斛蘭品種組內(nèi)雜交種和組間雜交種比例相當(dāng)，組內(nèi)雜交種黑毛組最多，組間雜交種蝴蝶組和羚羊組最多等［1］，從譜系關(guān)系上揭示藥用石斛雜交工作開(kāi)展方向。在藥用石斛種質(zhì)改良上，蔡永萍通過(guò)雜交技術(shù)以霍山石斛、細(xì)莖石斛為母本對(duì)霍山石斛進(jìn)行種質(zhì)改良，結(jié)果表明其F1代的年生莖鮮重分別為親本霍山石斛、細(xì)莖石斛的4.23、1.11倍，產(chǎn)量分別為親本的3.91、1.11倍，有效藥用成分和營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)于細(xì)莖石斛，比霍山石斛略低，F(xiàn)1代石斛多糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征與兩親本相似，雜交后代石斛多糖的結(jié)構(gòu)特征沒(méi)有較大的變化，F(xiàn)1代石斛多糖復(fù)合物的體外清除自由基的作用與兩親本相似，雜交不影響其后代石斛多糖體外清除自由基的能力［22］，揭示了藥用石斛可以通過(guò)人工雜交技術(shù)進(jìn)行品質(zhì)提升和種質(zhì)改良。

藥用石斛品種選育取得了階段性成果。從表2、表3可以看出，目前藥用石斛已選育出新種質(zhì)54個(gè)，按審定和登記地區(qū)劃分，云南選育品種34個(gè)、廣東11個(gè)、浙江5個(gè)、廣西2個(gè)、四川1個(gè)、福建1個(gè)，以云南最多；從品種上劃分，鐵皮石斛有38個(gè)、齒瓣石斛5個(gè)、金釵石斛1個(gè)、疊鞘石斛1個(gè)、鼓槌石斛1個(gè)、兜唇石斛1個(gè)、球花石斛1個(gè)、細(xì)莖石斛1個(gè)、霍山石斛1個(gè)；從藥用石斛育種現(xiàn)狀來(lái)看，目前仍以選育鐵皮石斛品種為主［17，23-24］，齒瓣石斛［25］、金釵石斛、鼓槌石斛［26］、疊鞘石斛［27］等也有新品種推出，但總體數(shù)量相對(duì)偏少。

表2 廣東、浙江等主產(chǎn)區(qū)審（認(rèn)）定的石斛品種

表3 云南省注冊(cè)登記的石斛品種

2.2 誘變育種

誘變育種是在人為條件下利用物理、化學(xué)等因素誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變，從中選擇和培育新品種的重要方法，物理誘變應(yīng)用較多的是輻射誘變，即用α、β、γ射線、Χ射線、中子等物理因素誘發(fā)變異，徐程、詹忠根、謝小波等利用137Csγ射線輻照鐵皮石斛原球莖，輻照半致死劑量（LD50）在67.23～86.4 Gy之間，且外部形態(tài)發(fā)生改變的植株，其DNA的倍性發(fā)生了改變，出現(xiàn)相當(dāng)多的非整倍體［28-30］。郭玉梅等采用人工模擬UV-B輻射照射處理鐵皮石斛幼苗，植株總多糖、總黃酮、總生物堿含量等主要次生代謝產(chǎn)物增加［31］?；瘜W(xué)誘變方面，金清等利用一氧化氮（NO）的供體硝普鈉（SNP）處理霍山石斛雜交種的類原球莖能提高組培藥用石斛生物堿含量［32］。顯然，誘變育種是選育藥用成分含量高、適應(yīng)性及抗逆性較強(qiáng)的石斛新優(yōu)品種的新途徑。但目前尚未見(jiàn)利用甲基磺酸乙酯（EMS）等烷化劑、5-溴尿嘧啶（BU）等核酸堿基類似物、重氮絲氨酸等抗生素處理藥用石斛的化學(xué)誘變的報(bào)道。

2.3 倍性育種

倍體育種是目前植物新品種選育的常用手段，利用多倍體植物的巨大性、旺盛的新陳代謝和較強(qiáng)的抗逆性可提高藥用石斛產(chǎn)量、石斛堿和多糖含量及獲得抗逆品種。由于利用物理方法誘導(dǎo)多倍體的誘導(dǎo)率不高，且在蘭花多倍體育種中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，目前石斛多倍體育種的誘導(dǎo)常用秋水仙素等化學(xué)藥劑處理為主［33］。廖蘇梅用秋水仙素誘導(dǎo)鐵皮石斛多倍體，結(jié)果表明原球莖或已萌發(fā)的種胚經(jīng)秋水仙素溶液浸泡后再培養(yǎng)，或者把種胚接種在添加秋水仙素培養(yǎng)基中，均可誘發(fā)鐵皮石斛多倍體，以萌發(fā)40 d的種胚在0.3%秋水仙素中浸泡36 h，誘變率最高，達(dá)63.51%［34］；李涵等用秋水仙素處理齒瓣石斛叢生芽以0.03%處理24 h誘導(dǎo)效果最好［35］；徐程利用濃度0.05%的秋水仙素處理種胚原球莖10 d獲得鐵皮石斛四倍體植株［28］；張靜靜在培養(yǎng)基中添加秋水仙素的方法處理鐵皮石斛類原球莖和種子，發(fā)現(xiàn)種子在秋水仙素濃度為50 mg/L的處理，誘導(dǎo)率高達(dá) 50%，且多是四倍體［36］；卓孝康用浸泡法和混配法對(duì)大苞鞘石斛進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，結(jié)果浸泡法以秋水仙素濃度為0.1%、處理時(shí)間為12 h，誘變率最高，達(dá)26.0%，混配法以秋水仙素濃度為0.03%的誘導(dǎo)效果最好，誘變率達(dá)34.0%［37］。經(jīng)誘導(dǎo)處理石斛多倍體植株在形態(tài)、氣孔直徑以及染色體數(shù)目上均有明顯的改變，形態(tài)上出現(xiàn)植株粗矮、節(jié)間短、叢生且生長(zhǎng)緩慢等顯著特征［35-36］；誘導(dǎo)的鐵皮石斛四倍體植株莖的多糖含量只是二倍體的1.31倍，未達(dá)顯著水平［38］。在藥用石斛中是否存在能同時(shí)提高多糖含量及生物產(chǎn)量的多倍體資源類型仍有待深入研究。

2.4 基因工程育種

隨著生物遺傳機(jī)制探討的深入，在分子水平上干預(yù)生物遺傳特性的技術(shù)日漸成熟。在石斛自身功能基因研究上，據(jù)李清等統(tǒng)計(jì)2011—2016年國(guó)內(nèi)已克隆參與石斛生長(zhǎng)發(fā)育、糖類代謝和菌根互作等類的功能基因40多個(gè)［39］，為今后通過(guò)石斛自身基因調(diào)控人為提高藥用石斛產(chǎn)量和活性成分含量提供了重要的參考依據(jù)；2016年1月鐵皮石斛全基因組圖譜公布，更為深入揭示鐵皮石斛多糖合成、花形態(tài)建成及抗逆等基因調(diào)控機(jī)制、其他藥用石斛種質(zhì)資源的各項(xiàng)生命活動(dòng)分子機(jī)制及人工合成藥用活性成分奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［40］；在遺傳轉(zhuǎn)化上常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是應(yīng)用最廣最成功的方法，目前在石斛上已成功導(dǎo)入基因的有抗細(xì)菌軟腐病基因aii A-hac D［41］、大麥抗耐鹽基因lea3［42］、調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育與抵御脅迫基因NAC［43］、抗建蘭花葉病毒外殼蛋白基因（Cy MV-CP）［44］等。隨著研究的持續(xù)深入，分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因編輯技術(shù)將是輔助藥用石斛新品種選育的重要技術(shù)手段。

3 展望

石斛作為道地藥材，目前國(guó)內(nèi)僅有鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛等主要品種的控制性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)霍山石斛、齒瓣石斛、細(xì)莖石斛等實(shí)際產(chǎn)量較大的藥用石斛的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，石斛是傳統(tǒng)的多基原名貴中藥材，藥材基原復(fù)雜，不同種類石斛化學(xué)成分差異較大，且部分種類石斛還含有種內(nèi)專屬性成分，在質(zhì)量管理上不宜套用現(xiàn)有的控制標(biāo)準(zhǔn)，建議管理部門(mén)今后加快霍山石斛、齒瓣石斛、細(xì)莖石斛、疊鞘石斛等藥用控制性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研發(fā)工作，為優(yōu)質(zhì)石斛資源的開(kāi)發(fā)利用工作做好基礎(chǔ)性工作。

從目前的藥用石斛保存利用現(xiàn)狀來(lái)看，種質(zhì)資源圃的建設(shè)得到了充分的重視，但鑒定與評(píng)價(jià)工作相對(duì)滯后；藥用石斛品種選育雖取得了階段性成果，但國(guó)內(nèi)選育品種較為集中，這對(duì)石斛產(chǎn)業(yè)的整體開(kāi)發(fā)是不利的；鑒于石斛屬植物已廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品、食品、化妝品領(lǐng)域，石斛品種選育目標(biāo)也應(yīng)可以兼顧多種用途。蔡永萍［22］利用種間雜交改良霍山石斛已獲得了有雜種優(yōu)勢(shì)兼具利用價(jià)值F1代種質(zhì)，雖然藥理藥效和實(shí)證性等還有待驗(yàn)證，和中醫(yī)藥界接受和采用雜交改良品種作為中藥基原材料還有一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程等，但利用傳統(tǒng)雜交優(yōu)勢(shì)改良品種將是培育藥用石斛種質(zhì)的新趨勢(shì)。利用誘變育種和倍性育種方法已為選育藥用成分含量高、適應(yīng)性及抗逆性較強(qiáng)的石斛新優(yōu)品種探索出新途徑，但距品種開(kāi)發(fā)尚有一段距離；在基因工程育種上，雖然功能基因克隆、基因組圖譜、轉(zhuǎn)基因成功導(dǎo)入已有較多研究，但分子研究在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用并不多。在今后藥用石斛新品種選育上，首先應(yīng)重視藥用石斛質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研發(fā)、種質(zhì)資源收集保存及資源圃的建設(shè)工作，加強(qiáng)珍稀優(yōu)質(zhì)石斛資源農(nóng)藝性狀和活性成分分析、鑒定與評(píng)價(jià)利用工作，從種源上保證藥材需要的人工培植的石斛道地性；其次，在藥用石斛新品種選育中要充分利用雜交優(yōu)勢(shì)選配親本進(jìn)行單交、回交、復(fù)交，創(chuàng)制出符合不同用途需求的雜交新種質(zhì)。再次，充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種，物理、化學(xué)誘變育種等多種育種方法進(jìn)行新品種培育，提高藥用石斛育種水平，滿足生產(chǎn)和市場(chǎng)的需要。