高子涵，王紅偉，呂行直，何云霞，劉 玲，王建剛，李瑞芳

（河南科技大學1.醫(yī)學院藥學系，2.護理學院，河南洛陽 471023）

目前，我國肝病的患病率居高不下，診斷和治療藥物的療效也不盡如意。急性肝損傷是多類嚴重性肝病發(fā)生發(fā)展的初始環(huán)節(jié)和共同歷程。柴胡（Radix Bupleuri）在傳統(tǒng)中醫(yī)記載中常用于和解表里、疏肝解郁等。目前已應用于臨床的柴胡制劑包括柴苓護肝顆粒、護肝片和護肝膠囊等［1］，其有效成分柴胡皂苷（saikosaponin，SS）具有解熱抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保肝護腎等作用，且對肝的保護作用最佳［2-3］。SS的結(jié)構(gòu)包括環(huán)氧醚型（如SS-a，-c和-d等）和異環(huán)雙烯型（如SS-b1和-b2等），是五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物［4］。其中SS-a，SS-c和SS-d有明顯的護肝和抗腫瘤等藥理作用［5-7］，SS-d對實驗性大鼠肝硬化有較強的抑制作用，還可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5，8-9］。SS-b2是SS的主要藥理活性成分之一，在柴胡中含量較低，在肝損傷防治方面的研究報道較少。本研究采用過氧化氫（H2O2）誘導L-02細胞損傷模型探討SS-b2對肝細胞損傷的保護作用及其與線粒體凋亡相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品、試劑和儀器

正常人肝細胞L-02（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，本研究室保存?zhèn)鞔S-b2（純度＞99%，成都曼思特生物科技有限公司，17032104）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco公司）；H2O2、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、Hoechst33258、羅丹明123、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液和ECL顯色劑試劑盒（Sigma公司）；AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；小鼠抗人Bcl-2、Bax、Cyt-c、β肌動蛋白、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3單抗（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（武漢三鷹生物技術有限公司）。

細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司）；SW-CJ-2J潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Nikon公司）；Bio-TekELX800酶標儀（美國Bio-Tek公司）；BD accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；DYY-11B型三恒電泳儀和DYCP-31DN型電泳儀（北京六一儀器廠）；Clinx ChemiScope2850熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

復蘇的L-02細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。2～3 d胰酶消化傳代1次，全程在超凈臺中無菌操作。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期的L-02細胞，胰酶消化并計數(shù)，稀釋后每孔5×103細胞接種于96孔培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察，待細胞密度為70%～80%，分為正常對照組、模型組和SS-b2組，每組4復孔，實驗重復3次。正常對照組和模型組給予等量培養(yǎng)液，SS-b2組分別加入SS-b2 12.5，25，50和100 mg·L-1（終濃度）預處理24 h后，除正常對照組外，其余各組再加入H2O2100 μmol·L-1繼續(xù)孵育12 h，而后每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），4 h后棄培養(yǎng)上清液，再加入200 μL DMSO，避光振蕩10 min，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度（A490nm）值。細胞存活率（%）=藥物組A490nm/正常對照組A490nm×100%。

1.4 羅丹明123染色法檢測L-02細胞線粒體膜電位變化

接種L-02細胞于6孔板，細胞分組與藥物處理同1.3。吸出含藥培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3次，加入終濃度為100 μg·L-1羅丹明123染色液浸潤細胞，37℃染色30 min，加細胞固定液1 mL，37℃固定1 h，最后滴加抗熒光衰減封片劑，于熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光強度（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm），ImageJ熒光圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。實驗重復3次。

1.5 Hoechst33258染色觀察L-02細胞凋亡

接種L-02細胞于6孔板，細胞分組與藥物處理同1.3。棄含藥培養(yǎng)液，每孔加細胞固定液（4%多聚 甲 醛）400 μL，室 溫 固 定 10 min，PBS 洗3次，再加1 mL Triton X-100 5 g·L-1，室溫5 min后PBS洗3次，最后加入Hoechst33258染色液（5 mg·L-1）1 mL，于37℃孵育5～10 min后吸去Hoechst33258染色液，PBS洗3次，每次5 min；用熒光顯微鏡（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長360 nm）觀察核固縮、核碎裂和高亮藍色熒光等凋亡形態(tài)學特征，計數(shù)視野內(nèi)凋亡細胞。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測L-02細胞凋亡率

接種L-02細胞于6孔板，細胞分組與藥物處理同1.3。吸出培養(yǎng)液，用PBS洗細胞2次，加入胰酶消化，用培養(yǎng)液終止消化并離心收集細胞，按照BD公司AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟進行。用1×結(jié)合緩沖液〔HEPES/NaOH 0.1 mol·L-1（pH 7.4），NaCl 1.4 mol·L-1，CaCl225 mmol·L-1〕重懸細胞，使細胞密度為1×109L-1。取100 μL細胞懸液置5 mL培養(yǎng)管中，依次加入AnnexinⅤ-FITC（20 mg·L-1）和PI（50 mg·L-1）各5 μL，混勻。室溫避光反應20 min，立即使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Western蛋白印跡法檢測細胞線粒體凋亡通路相關蛋白表達

接種L-02細胞于6孔板，細胞分組與藥物處理同1.3。收集細胞并加入RIPA裂解液，提取各組細胞總蛋白，定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別加入抗β肌動蛋白、Bcl-2、Bax、Cyt-c、胱天蛋白酶9和3抗體（一抗）（均1∶1000），37℃孵育1 h；TBST洗3次后，加入二抗（1∶6000）于37℃孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，采用Gel-Pro analyzer4.0凝膠定量分析軟件，對蛋白條帶積分吸光度值進行半定量分析。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度的比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均以表示，用SPSS17.0分析軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey′s檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SS-b2對H2O2損傷的L-02細胞存活率的影響

H2O2100 μmol·L-1處理12 h后，模型組細胞存活率下降至（45.4±1.3）%（P＜0.01）；與模型組比較，SS-b2預處理24 h顯著抑制H2O2所致的L-02細胞損傷，SS-b2 12.5，25，50和100 mg·L-1組細胞存活率分別上升至（51.6±1.4）%，（56.5±2.4）%，（64.4±1.5）%和（74.6±3.7）%（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性（r=0.9804，P＜0.05）（表1）。

2.2 SS-b2對H2O2誘導的L-02細胞線粒體損傷的影響

羅丹明123在正常細胞中能依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質(zhì)，胞漿熒光強度減弱或消失。細胞凋亡時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）的崩潰，羅丹明123被釋放出線粒體，從而胞漿發(fā)出強黃綠色熒光。與正常對照組相比，模型組細胞綠色熒光強度顯著增強（P＜0.01）；SS-b2 12.5，25和50 mg·L-1組綠色熒光強度較模型組綠色熒光強度顯著降低（P＜0.01），提示SS-b2能減輕H2O2誘導的L-02細胞線粒體損傷（圖1）。

Tab.1 Effect of saikosaponin-b2（SS-b2）on cell viability of L-02 cells treated with hydrogen peroxide（H2O2）

2.3 SS-b2對H2O2誘導的L-02細胞凋亡的影響

Hoechst33258染色結(jié)果（圖2）顯示，正常對照組細胞形態(tài)均一，細胞核呈圓形或橢圓形；模型組細胞核固縮，呈高亮藍色熒光，細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，SS-b2 12.5，25和50 mg·L-1組細胞核固縮現(xiàn)象明顯減輕，細胞凋亡率降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈濃度依賴關系（r=0.8193，P＜0.05）。

流式細胞檢測結(jié)果（圖3）顯示，模型組細胞凋亡率較正常對照組明顯升高〔（68.4±6.3）%vs（3.5±1.6）%〕（P＜0.01）；與模型組比較，SS-b2 12.5，25和50 mg·L-1組細胞凋亡率分別降為（64.8±5.4）%，（47.9±3.4）%和（44.3±3.5）%，其中SS-b2 25和50 mg·L-1組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示SS-b2對H2O2誘導的L-02細胞凋亡有一定的抑制作用。

2.4 SS-b2對L-02細胞線粒體凋亡通路相關蛋白的影響

與正常對照組比較，模型組細胞Bax（P＜0.01），Cyt-c（P＜0.01），胱天蛋白酶9（P＜0.05）和3（P＜0.05）蛋白表達顯著升高，而Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，SS-b2 12.5，25和50 mg·L-1組Bax，胱天蛋白酶9和3蛋白表達顯著降低（P＜0.01），SS-b2 25和50 mg·L-1組Cyt-c蛋白表達顯著降低（P＜0.01），而SS-b2 12.5，25和50 mg·L-1組Bcl-2蛋白表達顯著升高（P＜0.01），使Bcl-2/Bax的比值升高，且呈濃度依賴性（r=0.9417，P＜0.01）（圖5）。

Fig.1 Effect of SS-b2 on mitochondrial injury of L-02 cells treated with H2O2by Rhodamine123 staining（×200）.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

Fig.2 Effect of SS-b2 on apoptosis of L-02 cells treated with H2O2by Hoechst33258 staining（×200）.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.3 Effect of SS-b2 on apoptosis rate of L-02 cells treated with H2O2by flow cytometry.See Tab.1 for the cell treat?ment.B was the semi-quantitative result of A.，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

Fig.4 Effect of SS-b2 on expressions of apoptosis related proteins in L-02 cells treated with H2O2by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B-F were the semiquantitative results of A.G was ratio of Bcl-2 to Bax.，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究以L-02細胞為研究對象，觀察了SS-b2對H2O2誘導的體外肝細胞損傷的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H2O2損傷組相比，SS-b2可明顯提高受損L-02細胞的存活率，減少H2O2引起的核固縮和核碎裂等凋亡形態(tài)改變，減少細胞凋亡。羅丹明123染色結(jié)果也表明，SS-b2能明顯改善氧化應激引起的L02細胞線粒體損傷。

細胞代謝過程中產(chǎn)生一系列的活性氧（reac?tive oxygen species，ROS），包括氧自由基、H2O2及下游氧化產(chǎn)物等。研究發(fā)現(xiàn)，大量ROS可通過氧化應激反應誘導細胞功能紊亂甚至死亡［10］。H2O2可作為信使參與細胞內(nèi)氧化還原途徑，導致細胞凋亡［11］。H2O2具有膜滲透性，更易穿透細胞膜造成細胞損傷，引起線粒體膜電位下降。H2O2可活化線粒體通透轉(zhuǎn)變通道，使線粒體膜通透性增加、孔道開放，線粒體內(nèi)容物（如Cyt-c）進入細胞質(zhì)，通過Apaf-1與胱天蛋白酶9形成凋亡小體，最終激活胱天蛋白酶3，誘導細胞凋亡［12］。本研究結(jié)果表明，H2O2處理后促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低，胱天蛋白酶3激活；SS-b2可升高Bcl-2/Bax比值，使線粒體凋亡通路相關蛋白Cyt-c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的蛋白表達水平顯著降低。

綜上所述，SS-b2可明顯減輕氧化應激導致的L-02細胞損傷，其機制可能與保護線粒體結(jié)構(gòu)、減少線粒體凋亡及減輕細胞損傷有關。