李佳男，趙欣慰，郭 斌，吳敬敬

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧錦州 021001；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023；3.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116044）

氟他胺（flutamide，F(xiàn)lu）是一種非甾體雄激素拮抗劑，因其在前列腺癌治療方面效果顯著而在臨床廣泛應(yīng)用，成為晚期前列腺癌的首選治療藥物［1］，但嚴(yán)重的不良反應(yīng)也是用藥過程中不容忽視的問題［2］。研究發(fā)現(xiàn)，羥基化和水解過程是Flu在人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的2條重要代謝通路。其中，經(jīng)由細胞色素P450 1A2（cytochrome P450 1A2，CYP1A2）酶催化生成的2-羥基氟他胺是發(fā)揮抗癌作用的重要活性產(chǎn)物；而另一條通路可由羧基酯酶2（carboxy?lesterase 2，CES2）水解生成〔4-硝基-3-（三氟甲基）苯胺，F(xiàn)lu-1〕，后者會進一步被CYP3A4和CYP2C9代謝生成2種代謝產(chǎn)物：2-氨基-5-硝基-4-（三氟甲基）苯酚（Flu-3）和Flu-1的N-羥基代謝物（Flu-1 N-OH）。其中，大部分Flu-3經(jīng)尿液排出體外，而Flu-1 N-OH則可作為一種代謝活性中間體，與體內(nèi)的谷胱甘肽等大分子蛋白結(jié)合引發(fā)氧化損傷，這也是Flu導(dǎo)致肝毒性的主要因素［3-5］。藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，服用Flu 2～4 h后，由CES2所催化生成的Flu-1的血漿濃度可達到220 μg·L-1。除遲發(fā)性腹瀉等不良反應(yīng)外，由Flu所引發(fā)的肝毒性發(fā)生率可達到0.36%～9%，且死亡率較高［6-7］。雖然市面上有多種緩解或減輕肝毒性的藥物，但實際效果并不顯著［8-9］。CES2［10］和CYP1A2［11］皆為體內(nèi)重要的Ⅰ相代謝酶，參與多種內(nèi)源性及外源性化合物的代謝，其中CES2主要代謝具有較大醇基和較小?；幕衔铮?2-13］，CYP1A2則參與絕大部分藥物的氧化與還原代謝［14-15］。由此可推測，通過抑制CES2的活性從而阻斷Flu的水解過程，不僅可以提高Flu的藥效，還能顯著降低肝毒性風(fēng)險。

隨著對中藥研究的不斷深入，在中藥提取物中發(fā)現(xiàn)越來越多的代謝酶抑制劑，如丹參新酮和洋甘菊揮發(fā)油成分對CYP1A2活性均具有極強的抑制作用（IC50＜10 μmol·L-1）［11，14］；甘草提取物中的甘草次酸及其多種類似物可明顯抑制CES2的活性（IC50＜10 μmol·L-1）［16］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，紫草素（shikonin）10 μmol·L-1可抑制55% 的CES2活性，且這種抑制效果在活細胞中仍然存在［17］。但對Flu水解過程中的CES2活性影響仍待研究。

從紫草根部提取出來的天然萘醌型化合物紫草素，除具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化等多種藥理學(xué)活性外，對骨肉瘤、慢性粒細胞白血病和乳腺癌等也表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性［18-20］。此外，以紫草素為主要成分的藥物制劑在亞洲及歐洲的大部分國家中已被廣泛應(yīng)用。在將紫草素與拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑拓撲替康聯(lián)用時發(fā)現(xiàn)，細胞周期延長，細胞增殖減緩，二者表現(xiàn)出較好的協(xié)同抗癌效果［21-22］。因此推測，紫草素與Flu聯(lián)用時不僅可以降低肝毒風(fēng)險，同時發(fā)揮藥效協(xié)同作用，達到減毒增效的目的。

本研究采用體外肝微粒體孵育體系模擬體內(nèi)代謝環(huán)境，在確定Flu的水解反應(yīng)動力學(xué)的基礎(chǔ)上，深入考察紫草素分別對Flu代謝的2種關(guān)鍵酶CYP1A2和CES2的抑制作用，同時定量預(yù)測其體內(nèi)抑制可能性，對臨床聯(lián)合用藥策略具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

標(biāo)準(zhǔn)品：紫草素（批號wkq1600501）和Flu（批號L-Q400086），純度均＞98%（四川維克奇生物科技公司）。NADPH（批號264671，瑞士羅氏）。7-乙氧基試鹵靈（批號130508，中國美侖生物）。人肝微粒體（human liver microsome，HLM）（美國 Biorecla?matiIVT）；乙腈、甲醇和二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均為高效液相級別（美國賽默飛世爾科技有限公司）。協(xié)同H1多功能混合酶標(biāo)儀（美國伯騰公司），高效液相色譜儀（HPLC系統(tǒng)，日本島津公司）。

根據(jù)文獻［23］，選定7-乙氧基試鹵靈的發(fā)光檢測Gain值為80，積分時間為1 s。此外，根據(jù)預(yù)實驗確定7-乙氧基試鹵靈的激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為590 nm。

利用高效液相色譜儀對Flu及其代謝物Flu-1進行檢測，系統(tǒng)裝配有1個DGU-20A真空脫氣器，2個LC-30AD泵，1個SIL-30AC自動取樣器，CTO-30A柱溫箱和RF-20A熒光檢測器，1個CTO-20AC圓柱溫箱和1個SPD-M 20A二極管陣列探測器。1個島津的XR-ODSⅡ分析柱（75 mm×2.0 mm，2.2 μm）和1個ODS保護柱（5.0 mm×2.0 mm，2.2 μm，日本島津）。流動相的組成為乙腈（B）和水（A），分析梯度設(shè)置為：0～3.00 min，10%～60%B；3.00～6.00 min，60%B；6.00～10.00 min，60%～90%B；10.00～15.00 min，90%～10%B；15.00～18.00 min，10%～1%B。流速為0.3 mL·min-1，柱溫保持在40℃，進樣體積為10 μL，檢測波長為230 nm。

1.2 氟他胺水解線性反應(yīng)時間與線性微粒體濃度的測定

分別設(shè)定不同孵育時間（5，10，15，25，40和60 min）與不同濃度的HLM（0.1，0.2，0.4，0.5，0.6和0.8 g·L-1）進行體外孵育實驗，200 μL孵育體系〔4 μL HLM+194 μL PBS（100 mmol·L-1）+2 μL Flu（10 μmol·L-1）〕，在37 ℃恒溫振蕩混勻儀中預(yù)孵育10 min，加入Flu啟動水解反應(yīng)，繼續(xù)孵育相應(yīng)時間后，向反應(yīng)體系中加入等體積冰乙腈劇烈振蕩終止反應(yīng)，經(jīng)20 000×g，4℃離心20 min去除蛋白質(zhì)，取上清液于進樣瓶中放入高效液相色譜儀中，檢測其代謝產(chǎn)物的生成量。

1.3 氟他胺水解反應(yīng)動力學(xué)的測定

按1.2測定的最優(yōu)反應(yīng)時間和HLM濃度，設(shè)定Flu濃度為10，25，40，50和60 μmol·L-1，重復(fù)1.2中的孵育步驟，將 4 μL HLM（0.4 g·L-1）與 194 μL PBS（100 mmol·L-1）在37℃恒溫振蕩混勻儀中預(yù)孵育10 min后，加入2 μL Flu啟動水解反應(yīng)，繼續(xù)孵育40 min后終止反應(yīng)，離心取上清液后，再利用高效液相色譜法檢測產(chǎn)物生成情況。

1.4 紫草素對氟他胺水解反應(yīng)的抑制動力學(xué)測定

依照上述孵育條件，首先，設(shè)置15組不同的紫草素濃度（0，0.2，0.5，0.7，1，3，5，7，10，20，30，50，60，80和100 μmol·L-1）進行半數(shù)抑制濃度（IC50）測定；其次，采用多組Flu濃度（5，15，30和45 μmol·L-1）和紫草素濃度（0，5，10，15和25 μmol·L-1）對抑制動力學(xué)常數(shù)（Ki）進行測定，其他實驗步驟參考1.2。反應(yīng)40 min后，加入等體積冰乙腈，充分混勻終止反應(yīng)，然后4℃下20 000×g離心20 min，取上清液放入高效液相色譜儀中進行檢測。分析方法參考文獻［24-25］。用GraphPad Prism對數(shù)據(jù)進行分析。IC50與抑制強度成反比。通過使用競爭型抑制（式1）、非競爭型抑制（式2）或混合型抑制（式3）3種動力學(xué)模型進行非線性回歸分析，計算Ki值。

式中，v是反應(yīng)速度；S和I分別為底物和抑制劑濃度；Ki是描述抑制劑對酶的親和力抑制常數(shù)；Km是1/2最大反應(yīng)速度（Vmax）時的底物濃度。α值決定抑制劑改變酶對底物的親和力程度。當(dāng)α很大時（α＞1）抑制劑與酶的結(jié)合阻礙底物的結(jié)合，混合型抑制與競爭型抑制相同。從數(shù)據(jù)擬合和酶抑制類型確定抑制類型。從R2值、測定參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差、95%置信區(qū)間對動力學(xué)和抑制類型進行最好的擬合與評估。

1.5 紫草素對CYP1A2活性抑制作用的測定

采用三點法進行初篩實驗，設(shè)置3個濃度梯度的紫草素（1，10和100 μmol·L-1），查閱文獻確定CYP1A2的熒光底物7-乙氧基試鹵靈的濃度為6 μmol·L-1［26］，將含有 4 μL HLM（0.4 g·L-1），174 μL PBS（100 mmol·L-1）及 2 μL7-乙 氧 基試鹵 靈（6 μmol·L-1）的體系于恒溫混勻儀中預(yù)孵育10 min，加入20 μL NADPH（100 mmol·L-1）啟動反應(yīng)，反應(yīng)60 min后加入等體積的冰乙腈終止反應(yīng)。4℃下20 000×g離心20 min，取上清液放入熒光酶標(biāo)儀，檢測其熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。預(yù)實驗中的方法學(xué)驗證HPLC分析氟他胺羥化產(chǎn)物的回收率＞86%，準(zhǔn)確率＞94%，相對標(biāo)準(zhǔn)差＜1.8%。不同濃度的紫草素對CYP1A2的抑制強度用殘余活性表示，對照組以等體積溶劑〔2 μL甲醇（1%，V/V）〕替代，計算殘余活性。殘余活性（%）=藥物組FI/對照組FI×100%。

1.6 紫草素對氟他胺水解反應(yīng)抑制強度的預(yù)測

利用紫草素的最大血藥濃度（Cmax）及Flu的肝提取率（Eh）來估計濃度時間曲線下面積（area under the concentration-time curve，AUC）的改變，計算紫草素所導(dǎo)致的Flu在體內(nèi)暴露水平的變化Cmax/IC50，即AUC增幅（式4）。其中Flu的Eh通過式5進行預(yù)測。參考文獻，紫草素在體內(nèi)的Cmax為5.53～37.4 μmol·L-1［27-29］。參考文獻中Flu 在體內(nèi)經(jīng)HLM中CES2代謝的Vmax值（Vmax=1.113 mol·min-1·mg-1蛋白）［3］，F(xiàn)lu的Km通過 1.3實驗測定（Km=15 μmol·L-1）；Flu的fm（0.18）及fu（0.51）［6］；fhep設(shè)定為1；Qh及MSP按1.29 L·min-1和61.88 g進行計算［6］，對FLU的Eh預(yù)測。參考FDA提出的藥物相互作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)［30］，以此推測紫草素對Flu水解過程的抑制。

其中fhep是由CES2介導(dǎo)的肝清除百分比；I為血漿中抑制劑的濃度；fm代表由CES2介導(dǎo)的代謝清除占總代謝清除率的百分?jǐn)?shù)或比例；fu為非結(jié)合部分；Km（μmol·L-1）為底物與酶的親和力常數(shù)；Vmax（mol·min-1·mg-1蛋白）為最大反應(yīng)速度；Qh（L·min-1）為人肝血流量；MSP（g）是HLM蛋白總量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，均采用GraphPad Prism進行雙側(cè)t檢驗分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟他胺最佳孵育時間和最佳微粒體濃度

如圖1所示，擬合的線性反應(yīng)時間中，0～40 min范圍內(nèi)Flu-1的生成量隨時間增加呈線性增加，在40 min后增長速率減慢；而HLM濃度增加至0.8g·L-1幾乎與產(chǎn)物生成量成正比，考慮到為避免蛋白結(jié)合因素干擾，體內(nèi)外酶動力學(xué)反應(yīng)中酶的濃度不宜超過0.5 g·L-1［31］，選擇HLM 0.4 g·L-1作為Flu的體外代謝酶濃度。因此，選定40 min為最佳孵育時間，0.4 g·L-1為最優(yōu)HLM濃度進行Flu的水解動力學(xué)實驗及紫草素對Flu水解抑制實驗。

Fig.1 Linear reaction time（A）and linear human liver microsome（HLM）concentration（B）curves of flutamide.

2.2 氟他胺的水解反應(yīng)動力學(xué)

Flu水解反應(yīng)動力學(xué)如圖2所示，代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化量在Flu為0～20 μmol·L-1期間呈線性趨勢增加，在 40 μmol·L-1時開始進入平臺期，經(jīng) GraphPad Prism擬合得出Flu的Km約為15 μmol·L-1。

2.3 紫草素對氟他胺水解反應(yīng)的抑制作用

以Flu為CES2底物，在不同濃度的紫草素作用下，CES2的殘余活性如圖3所示。經(jīng)GraphPad Prism擬合其IC50為7.01 μmol·L-1，可知紫草素可通過對CES2活性的抑制，對Flu的水解反應(yīng)產(chǎn)生強抑制作用。進一步選擇不同的紫草素濃度及Flu濃度測定紫草素的Ki值為7.88 μmol·L-1（表1），并通過Lineweaver-Burk及Dixon作圖對其抑制類型進行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)紫草素對Flu的水解作用呈現(xiàn)非競爭型抑制。

Fig.2 Metabolic kinetic curve of flutamide.

Fig.3 Concentration-response inhibition curve of shiko?nin towards hydrolysis reaction of flutamide.

Tab.1 Magnitude of potential inhibitory interaction of shikonin with CES2 was evaluated by estimating area under concentration-time curve（AUC）ratio in pres?ence or absence of shikonin.

Fig.4 Inhibitory kinetics of shikonin towards hydrolysis reaction of flutamide.A：Lineweaver-Burk plot for inhibition of shikonin towards hydrolysis reaction of flutamide；B：corre?sponding Dixon plot.

2.4 紫草素對CYP1A2活性的抑制作用

CYP1A2殘余活性如圖5所示。當(dāng)紫草素濃度為100 μmol·L-1時，CYP1A2的殘余活性＞55%，可推測紫草素對CYP1A2并不存在顯著性的抑制作用（IC50＞100 μmol·L-1）。

2.5 紫草素對氟他胺水解反應(yīng)抑制強度的定量預(yù)測

如表1所示，紫草素對CES2活性的抑制程度為：IC50為7.01 μmol·L-1，Ki為7.88 μmol·L-1。通過式5對Flu的Eh預(yù)測所得范圍為0.1～0.91。查閱文獻后計算紫草素在人體內(nèi)的Cmax為5.53～37.4 μmol·L-1。經(jīng)式4計算后可知，紫草素在體內(nèi)可顯著抑制Flu的水解過程，造成Flu在體內(nèi)暴露水平呈6%～43%的增加幅度，進而減輕不良反應(yīng)的發(fā)生。

Fig.5 Inhibitory effect of shikonin towards substrate（7-ethoxyresorufin）of CYP1A2.7-Ethoxyresorufin was incu?bated with HLMs at 37℃in absence and presence of shikonin（1，10 and 100 μmol·L-1），respectively.

3 討論

本研究通過建立體外孵育體系模擬體內(nèi)代謝環(huán)境，首先對Flu的水解反應(yīng)動力學(xué)、線性反應(yīng)時間及線性微粒體濃度進行摸索。以此為前提，考察紫草素對Flu代謝過程中2種關(guān)鍵酶CES2和CYP1A2的抑制作用。其中，紫草素在生理濃度（37.4 μmol·L-1）條件下，對CYP1A2幾乎沒有明顯的抑制作用（抑制率＜50%），即紫草素不會對Flu的羥基化進程產(chǎn)生明顯阻礙作用；相比之下，紫草素對水解作用酶CES2則存在極強的抑制作用，IC50為7.01 μmol·L-1，并以非競爭型方式發(fā)揮抑制作用，抑制Flu水解反應(yīng)，從而減少Flu-1的產(chǎn)生，達到減輕肝毒性的目的。在對紫草素的體內(nèi)定量預(yù)測時發(fā)現(xiàn)，紫草素可造成體內(nèi)Flu的暴露量增加6%～43%，具有抑制Flu水解從而減輕不良反應(yīng)的作用。此外，文獻報道，紫草素在體內(nèi)仍具有極強的抑制CES2活性的作用［17］，且在與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用時，可使抗腫瘤效果明顯增強［21］。由此可推測，在將紫草素作為抗腫瘤輔助用藥與Flu聯(lián)用時，發(fā)揮著減毒增效的作用，為將來開創(chuàng)新型臨床用藥策略提供極大的可能性。以此為依據(jù)，開發(fā)副作用較小的中藥與抗癌藥物聯(lián)用的用藥策略，可以在實現(xiàn)減毒增效的前提下優(yōu)化臨床安全用藥方案。