陳 琳， 管遠(yuǎn)紅， 黃東璋， 齊富剛， 張洪濤， 陳冬冬， 區(qū)卓麟， 于淼淼，吳懷秀， 楊雨秋， 陳瀛川， 王亞南， 蘇哲君， 張 歡

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

當(dāng)前，耐藥性是臨床抗感染治療面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)，抗耐藥菌感染已成為全球性臨床醫(yī)學(xué)重大難題[1-5]。研究表明，中藥對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌均有一定的影響和作用[6-10]。雖然從抗菌效價(jià)或抗菌作用強(qiáng)度比較，幾乎所有中藥的抗菌作用均弱于抗生素[11]，但是由于中藥不但可以作用于細(xì)菌繁殖的不同階段及多個(gè)代謝環(huán)節(jié)，中藥和西藥聯(lián)用還可以相得益彰，為臨床用藥提供更多的選擇[12]，同時(shí)，中藥能夠從整體上提高機(jī)體的免疫功能，減輕感染引起的病理?yè)p害，起到非特異性治療的作用[5]。如熊南燕等報(bào)道，體內(nèi)外無(wú)抗菌活性的魚(yú)腥草注射液，對(duì)兔體內(nèi)硫酸慶大霉素注射液抗菌活性有明顯增強(qiáng)作用[13]。

筆者所在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，中藥黃連、黃芩、五倍子、連翹等對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌有一定的抑制作用，而氨基糖苷類(lèi)抗生素是治療革蘭氏陰性菌感染的重要藥物，由于16S rRNA甲基化酶的出現(xiàn)，導(dǎo)致慶大霉素、阿米卡星等氨基糖苷類(lèi)抗生素在臨床抗革蘭氏陰性感染中喪失其作用。因此，本研究擬以構(gòu)建的16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌為研究對(duì)象，研究黃連、五倍子、黃芩等幾種中藥免煎顆粒聯(lián)合慶大霉素對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用，一方面為臨床用藥提供依據(jù)，另一方面，為16S rRNA甲基化酶耐藥菌感染提供更多的治療用藥選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株

16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌pRmtB1。質(zhì)控菌E.coliATCC 25922，購(gòu)自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。

1.2 培養(yǎng)基

水解酪蛋白肉湯(MH Broth)，水解酪蛋白瓊脂(MH agar)，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。紅四氮唑，購(gòu)自揚(yáng)州科能生物技術(shù)有限公司。

1.3 供試藥物

黃連顆粒(批號(hào)1501140，生藥含量3 g)、醋五味子顆粒(批號(hào)1502099，生藥含量6 g)、連翹顆粒(批號(hào)1411052，生藥含量10 g)、烏梅顆粒(批號(hào)1412062，生藥含量10 g)、黃芩炭顆粒(批號(hào)1303143，生藥含量10 g)、五倍子顆粒(批號(hào)1408125，上藥含量3 g)，均購(gòu)自江陰某藥業(yè)有限公司。硫酸慶大霉素(批號(hào)0304，含量590 μg/mg)。

1.4 受試藥液的制備及稀釋

稱(chēng)取受試中藥顆粒，分別用滅菌超純水溶解成如表1所示的藥物濃度，針頭濾器過(guò)濾后分裝，于-20 ℃或-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 藥物貯備液配制濃度

1.5 菌液制備

在MH瓊脂平板上挑取pRmtB1單個(gè)菌落接種于2～5 mL Muller-Hinton(MH)肉湯管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～8 h，用調(diào)節(jié)過(guò)鈣鎂離子的MH肉湯稀釋菌液，使稀釋菌液達(dá)到 0.5 麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?，再? ∶100稀釋菌液至含菌量約為 1×106CFU/mL，備用。

1.6 聯(lián)合用藥測(cè)定方法

采用棋盤(pán)微量稀釋法(Checkerboard Microdilution)[14-16]測(cè)定2種藥的部分抑菌濃度指數(shù)(frictional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)。具體操作如下：首先，應(yīng)用微量稀釋法測(cè)定2種藥物的MIC，作為棋盤(pán)稀釋法的中心濃度。然后分別以2種藥MIC的2、4、8、16倍及1/2、1/4、1/8倍稀釋藥物。取出無(wú)菌的96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，置于超凈工作臺(tái)，向96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板的前8行及前8列各孔中加入肉湯稀釋好的菌液(1×106CFU/mL )100 μL。然后分別沿縱軸加入不同濃度的甲藥50 μL，沿橫軸加入不同濃度的B藥 50 μL，A藥單沿橫軸1～7孔分別加入2倍稀釋的A藥 100 μL，B藥單沿縱軸1～7孔分別加入2倍稀釋的B藥 100 μL，第9列肉湯組只加入肉湯200 μL，第10列菌液組只加入菌液200 μL。加樣完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h。觀察結(jié)果前2 h，于細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔均加入0.5%的紅四氮唑溶液5 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別觀察記錄2種藥單獨(dú)作用的最低抑菌濃度(MICA及MICB)及聯(lián)合作用的最低抑菌濃度(MICAB及MICBA)。當(dāng)?shù)?0列菌液對(duì)照組的細(xì)菌明顯生長(zhǎng)，呈現(xiàn)紅色，第9列肉湯對(duì)照組無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，呈現(xiàn)無(wú)色，各試驗(yàn)組小孔內(nèi)能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MIC值(即第1個(gè)顏色不變的小孔所對(duì)應(yīng)藥物濃度即為MIC)。如出現(xiàn)單一跳孔，則記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度，如出現(xiàn)多孔跳孔的現(xiàn)象，則必須重新試驗(yàn)。

1.7 聯(lián)合用藥判定標(biāo)準(zhǔn)

按照下列公式計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)，按照表2的判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)2種藥物的聯(lián)合作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

式中：MICA為A藥單用時(shí)測(cè)得的MIC；MICAB為A、B 2種藥聯(lián)用時(shí)測(cè)得的A藥MIC；MICB為B藥單用時(shí)測(cè)得的MIC；MICBA為A、B 2種藥聯(lián)用時(shí)測(cè)得的B藥MIC。

表2 聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯(lián)合作用結(jié)果

表3 黃連與硫酸慶大霉素聯(lián)合對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結(jié)果

2.2 五倍子免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯(lián)合作用結(jié)果

2.3 連翹免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯(lián)合作用結(jié)果

表4 五倍子與硫酸慶大霉素聯(lián)合對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結(jié)果

表5 連翹與硫酸慶大霉素聯(lián)合對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結(jié)果

2.4 黃芩免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯(lián)合作用結(jié)果

表6 黃芩與硫酸慶大霉素聯(lián)合對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結(jié)果

2.5 烏梅免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯(lián)合作用結(jié)果

表7 烏梅與硫酸慶大霉素聯(lián)合對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結(jié)果

3 討論

聯(lián)合用藥是增強(qiáng)藥物療效、延緩或減少耐藥性產(chǎn)生的一種重要手段和方法。王耘等研究表明，貝母的有效成分貝母素乙聯(lián)合氨芐西林舒巴坦可逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對(duì)氨芐西林舒巴坦的耐藥性，三藥聯(lián)合的體內(nèi)抗菌作用增強(qiáng)。何明等研究雙黃連、清開(kāi)靈與頭孢哌酮聯(lián)合對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌所致敗血癥動(dòng)物模型的協(xié)同抗菌作用發(fā)現(xiàn)，雙黃連、清開(kāi)靈與頭孢哌酮聯(lián)合有協(xié)同抗菌作用，不但可提高抗生素對(duì)耐藥菌的療效，而且能降低抗生素的使用劑量[17-18]。傅瑞春聯(lián)合應(yīng)用Kirby紙片擴(kuò)散法、棋盤(pán)稀釋法及殺菌曲線法評(píng)價(jià)大黃素、大黃酸、隱丹參酮等中藥有效成分與青霉素、氨芐西林、阿米卡星等多種藥物聯(lián)合對(duì)耐藥菌的作用，結(jié)果顯示中藥與西藥聯(lián)合后，有的呈現(xiàn)協(xié)同作用，有的呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用，有的呈現(xiàn)相加作用[16]。本研究中，慶大霉素與五倍子聯(lián)合對(duì)耐藥重組菌具有協(xié)同作用，兩者的聯(lián)合抑菌濃度比單獨(dú)使用均有所降低，表明五倍子能降低慶大霉素的耐藥水平。另外，黃連、烏梅與慶大霉素聯(lián)合后抑菌效應(yīng)也有一定的增強(qiáng)，但不如五倍子與慶大霉素的聯(lián)合效應(yīng)明顯，而黃芩與慶大霉素聯(lián)合后呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用。

4 結(jié)論

中藥五倍子與慶大霉素聯(lián)合有協(xié)同作用，黃連、烏梅與慶大霉素聯(lián)合有相加作用，連翹與黃芩與慶大霉素聯(lián)合呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用。中藥五倍子有望成為慶大霉素抗耐藥菌感染協(xié)同劑。