劉超猛，王梅子，邢文龍，張桂青

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder,PTSD）為一種與創(chuàng)傷有關(guān)，并常伴睡眠損害的疾病[1-2]。褪黑激素被視為生理周期的標(biāo)志[3]。阿戈美拉汀作為首個褪黑素受體MT1和MT2的激動劑，可以通過修復(fù)慢性輕度應(yīng)激模型大鼠紊亂的晝夜節(jié)律，來減輕PTSD癥狀[3-4]。筆者采用單次延長結(jié)合足底電擊應(yīng)激（single prolonged stress﹠foot shock, SPS&S）模型[5]，在模型復(fù)制成功后12 h內(nèi)給予阿戈美拉汀，探究其對大鼠恐懼、焦慮行為及學(xué)習(xí)記憶能力減退是否有預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

32只6～8周健康雄性清潔級SD大鼠，體重（180±20）g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心[動物許可證號：SCXK（新）2016-0001]。12 h晝/夜循環(huán)照明，環(huán)境溫度20～25℃，濕度約為50%，自由進(jìn)食、飲水。飼養(yǎng)箱內(nèi)鋪墊適量木材刨花，使大鼠免于不必要的身體傷害，實驗前1周使大鼠適應(yīng)新環(huán)境，以穩(wěn)定情緒。

1.2 實驗分組

采用2×2析因設(shè)計，2個因素為：①SPS&S刺激，即應(yīng)激，設(shè)為因素A；②阿戈美拉汀給藥，即給藥，設(shè)為因素B。每個因素各有2個水平：A為應(yīng)激與否，B為給藥與否。因素與水平全面組合后，隨機(jī)等分為空白對照組（不給藥，不應(yīng)激）、單純應(yīng)激組（不給藥，應(yīng)激）、藥物組（給藥，應(yīng)激）和單純藥物組（給藥，不應(yīng)激）4組，每組8只。藥物組和單純藥物組通過灌胃給予阿戈美拉汀2.6 mg∕（kg·d），阿戈美拉汀由江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供（國藥準(zhǔn)字H20143375）。該劑量是依據(jù)人和大鼠按體表面積折合的等效劑量比值計算而來[6]?？瞻讓φ战M和應(yīng)激組通過灌胃給予等量生理鹽水，共2周。整個實驗過程嚴(yán)格遵循石河子大學(xué)動物倫理委員會關(guān)于開展實驗動物研究的相關(guān)規(guī)定。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復(fù)制 依次通過持續(xù)束縛2 h，強(qiáng)制性游泳至大鼠力竭，乙醚麻醉至意識喪失，以及不可逃避的足底電擊復(fù)制SPS&S大鼠模型。①持續(xù)束縛是用韌性良好的保鮮膜將大鼠自上而下完全裹緊，再用膠帶封住頭尾兩端，僅在口鼻處留幾個透氣孔以保證大鼠正常呼吸，大鼠頭、軀干及尾巴均不能活動，持續(xù)束縛2 h后去除薄膜，等待2 min。②將大鼠放入一透明立方體游泳箱中（400 mm×300 mm×350 mm），水深300 mm，水溫（22±2）℃。一陣掙扎后（約20 min）大鼠懸停在水面不再動彈，取出擦拭干凈，等待10～15 min。③乙醚麻醉裝置為食品級塑料制成的透明帶小孔的長方形箱子（400 mm×150 mm×150 mm）。將大鼠放入麻醉箱內(nèi)，均勻傾倒適量99.5%無水乙醚，立刻密封。10 s左右大鼠出現(xiàn)呼吸抑制，不能站立，意識逐漸喪失。將其置于通風(fēng)良好的籠中，等待大鼠意識恢復(fù)。④聲光電箱裝置為一樹脂制成的木質(zhì)電擊箱，箱體內(nèi)一側(cè)安裝有1個噪音喇叭及1盞聚光燈，底部為導(dǎo)電的金屬細(xì)絲[7]。先讓大鼠在無光照環(huán)境適應(yīng)2 min，再予以10組噪音、聚光、電擊配對的刺激，包括：a.5 s噪音刺激+10 s 8 mA的足底電擊；b.2 s聚光刺激+10 s 8 mA的足底電擊；c.5 s噪音刺激+2 s聚光刺激+10 s 8 mA的足底電擊。每組刺激間隔時間隨機(jī)（20～120 s），不應(yīng)激的大鼠在電擊箱中不通電流，取出后將大鼠放回飼養(yǎng)籠中，不受打擾正常飼養(yǎng)2周。

1.3.2 模型評估 在復(fù)制SPS&S大鼠模型6 h內(nèi)，觀察大鼠的拒縛反應(yīng)和在Morris水迷宮[8]中的定位航行表現(xiàn)，綜合判斷模型復(fù)制是否成功。當(dāng)實驗人員佩戴專業(yè)手套抓取大鼠脊柱和腹部時，應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出尖叫、回避、掙脫甚至撕咬；而未應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出尋找、試探或者迎合，符合其性情溫順的特征。行Morris水迷宮實驗時，應(yīng)激的大鼠更多的是圍繞著水迷宮內(nèi)壁打轉(zhuǎn)，有類似恐懼、焦慮的反應(yīng)，或者找到水下平臺的航行距離大大增加；而未應(yīng)激大鼠總能在規(guī)定時間（設(shè)為2 min）找到隱藏在第2象限水下的平臺。見圖1。

圖1 復(fù)制SPS&S模型6 h內(nèi)應(yīng)激和不應(yīng)激大鼠在水迷宮中的航行示意圖

1.3.3 條件性恐懼反應(yīng) 第14天早上將大鼠放入電擊箱中3 min，保持周圍環(huán)境的安靜，不連接電流設(shè)備，實驗完成后立刻放回原籠中[9]。用紅外攝像機(jī)跟蹤大鼠的高警覺、恐懼表現(xiàn)，并計算其呆滯時間。呆滯表現(xiàn)是指實驗大鼠除呼吸表現(xiàn)出的腹部起伏動作外，觀察不到其他,例如行走、站立或抓撓等行為反應(yīng)。

1.3.4 曠場實驗 曠場實驗是評價動物自發(fā)活動及焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)實驗[10]。曠場實驗箱（900 mm×900 mm×500 mm）底部為16個等大的方格，中央4個為曠場中心區(qū)，其余被看作是邊緣區(qū)。第15天予以曠場實驗，操作流程：①測試前大鼠在箱中適應(yīng)10 s。②從曠場中間格子開始，在一側(cè)白熾燈照明（30 W）下，由頂端的紅外攝像機(jī)跟蹤大鼠在曠場15 min內(nèi)的行為表現(xiàn)。③每只大鼠實驗后用蘸酒精的毛巾擦拭其運動區(qū)域，以防大鼠間產(chǎn)生相互影響。記錄大鼠穿格次數(shù)（大鼠以3爪或4爪踏進(jìn)1個方格）和站立次數(shù)（大鼠用后肢支撐，前肢懸空的次數(shù)）。

1.3.5 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮裝置將水池等分為4個象限，距離靶象限池壁350 mm處設(shè)有一直徑80 mm、高400 mm的圓柱形透明站臺，位于水面上20 mm。池壁內(nèi)貼有投放大鼠位置的標(biāo)記物，迷宮正上方設(shè)有紅外攝像機(jī)，同步記錄大鼠在水迷宮中的表現(xiàn)。①定位航行能力：實驗前從任意方向?qū)⒋笫笾糜谡九_上熟悉周邊環(huán)境15 s，隨后隨機(jī)將大鼠從非靶象限面壁放入池內(nèi)。大鼠找到站臺5 s后停止實驗，尋找時間為60 s，若大鼠在規(guī)定時間內(nèi)找不到站臺，可用鼠棒指引其在站臺適應(yīng)10 s。將大鼠放入游泳池4次，測定平均上臺潛伏期，以評價大鼠的定位航行力。在模型復(fù)制后第16～20天重復(fù)以上步驟，除時間上的差別外，實驗方法和大鼠飼養(yǎng)條件相同。②空間探索力：第21天移除靶象限中的站臺，將大鼠面壁放入池內(nèi)1次，記錄大鼠在迷宮60 s內(nèi)的表現(xiàn)。主要指標(biāo)為穿越站臺所在象限次數(shù)和第1次到達(dá)站臺時間，以評價大鼠的空間探索力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用析因設(shè)計的方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 恐懼反應(yīng)

應(yīng)激或給藥對電擊箱中大鼠呆滯時間的影響：各組大鼠呆滯時間比較，經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①應(yīng)激與否大鼠的呆滯時間比較有差別（F=370.915，P=0.000），應(yīng)激后呆滯時間增多；②給藥與否大鼠呆滯時間有差別（F=72.494，P=0.000），給藥后呆滯時間減少；③應(yīng)激與給藥存在交互作用（F=58.536，P=0.000）。見表 1。

表1 應(yīng)激或給藥對大鼠呆滯時間的析因分析（s，±s）

表1 應(yīng)激或給藥對大鼠呆滯時間的析因分析（s，±s）

給藥應(yīng)激合計（A因素）是否是41.63±8.14 83.75±11.39 62.69±23.76否11.38±4.00 13.63±2.33 12.50±3.37合計（B因素） 26.50±16.80 48.69±37.07 37.59±30.47

2.2 焦慮行為

2.2.1 應(yīng)激或給藥對曠場中大鼠跨格次數(shù)的影響 各組大鼠跨格次數(shù)比較，經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①應(yīng)激與否大鼠跨格次數(shù)有差別（F=36.648，P=0.000），應(yīng)激后跨格次數(shù)減少；②給藥與否大鼠跨格次數(shù)有差別（F=19.936，P=0.000），給藥后跨格次數(shù)增多；③應(yīng)激與給藥存在交互作用（F=40.135，P=0.000）。見表2。

2.2.2 應(yīng)激或給藥對曠場中大鼠站立次數(shù)的影響 各組大鼠跨站立數(shù)比較，經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①應(yīng)激與否大鼠站立次數(shù)有差別（F=7.077，P=0.013），應(yīng)激后站立次數(shù)減少；②給藥與否大鼠站立次數(shù)有差別（F=8.454，P=0.007），給藥后大鼠站立次數(shù)增多；③應(yīng)激與給藥不存在交互作用（F=1.106，P=0.302）。見表3。

表2 應(yīng)激或給藥對大鼠跨格次數(shù)的析因分析（次，±s）

表2 應(yīng)激或給藥對大鼠跨格次數(shù)的析因分析（次，±s）

給藥應(yīng)激合計（A因素）是否是42.25±6.65 16.38±3.93 29.31±14.37否40.388±7.56 45.88±7.06 43.13±7.61合計（B因素） 41.31±6.94 31.13±16.20 36.22±13.31

表3 應(yīng)激或給藥對大鼠站立次數(shù)的析因分析（次，±s）

表3 應(yīng)激或給藥對大鼠站立次數(shù)的析因分析（次，±s）

給藥應(yīng)激合計（A因素）是否是13.38±2.67 9.38±2.83 11.38±3.36否15.00±3.07 13.13±2.85 14.06±3.02合計（B因素） 14.19±2.90 11.25±3.36 12.72±3.43

2.3 學(xué)習(xí)能力

2.3.1 4組大鼠Morris水迷宮上臺潛伏期比較 4組大鼠模型復(fù)制后第16、17、18、19和20天的上臺潛伏期比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的上臺潛伏期有差別（F=54.732，P=0.000）；②4組上臺潛伏期有差別（F=5.523，P=0.004），藥物組與單純應(yīng)激組相比，上臺潛伏期縮短，相對學(xué)習(xí)能力提高；③4組上臺潛伏期變化趨勢有差別（F=50.886，P=0.000）。見表4和圖2。

2.3.2 應(yīng)激或給藥對Morris水迷宮實驗第21天大鼠第1次上臺潛伏期的影響 第21天各組大鼠第1次上臺潛伏期比較，經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①應(yīng)激與否大鼠第1次上臺潛伏期有差別（F=31.380，P=0.000），應(yīng)激后第1次上臺潛伏期延長；②給藥與否大鼠第1次上臺潛伏期有差別（F=11.927，P=0.002），給藥后第1次上臺潛伏期縮短；③應(yīng)激與給藥存在交互作用（F=13.009，P=0.001）。見表 5。

2.3.3 應(yīng)激或給藥對Morris水迷宮實驗第21天大鼠穿臺次數(shù)的影響 各組大鼠跨格次數(shù)比較，經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①應(yīng)激與否大鼠穿臺次數(shù)沒有差別（F=3.346，P=0.078）；②給藥與否大鼠穿臺次數(shù)沒有差別（F=2.459，P=0.128）；③應(yīng)激與給藥存在交互作用（F=4.371，P=0.046）（見表6）。典型航行軌跡示意圖見圖3。

表4 各組大鼠不同時間點上臺潛伏期比較 （n =8，s，±s）

表4 各組大鼠不同時間點上臺潛伏期比較 （n =8，s，±s）

組別 16 d 17 d 18 d 19 d 20 d空白對照組 54.14±12.52 51.70±9.12 37.28±18.17 24.19±9.93 16.80±13.42單純應(yīng)激組 57.18±6.01 50.47±10.48 46.97±9.21 37.00±12.30 36.95±12.44藥物組 57.22±5.11 51.34±8.10 34.13±14.32 26.76±16.36 17.34±9.76單純藥物組 55.45±5.44 51.18±10.90 30.34±11.75 26.43±16.67 17.26±8.76

圖2 各組大鼠上臺潛伏期變化趨勢 （n =8，±s）

表5 應(yīng)激或給藥對大鼠第1次上臺潛伏期的析因分析（s，±s）

表5 應(yīng)激或給藥對大鼠第1次上臺潛伏期的析因分析（s，±s）

給藥應(yīng)激合計（A因素）是否是16.59±11.45 37.26±10.76 26.92±15.14否10.75±2.93 10.30±4.36 10.52±3.60合計（B因素） 13.67±8.62 23.78±16.02 18.72±13.66

表6 應(yīng)激或給藥對大鼠穿臺次數(shù)的析因分析 （次，±s）

表6 應(yīng)激或給藥對大鼠穿臺次數(shù)的析因分析 （次，±s）

給藥應(yīng)激合計（A因素）是否是4.00±1.07 2.25±1.39 3.13±1.50否3.88±1.46 4.13±1.46 4.00±1.41合計（B因素） 3.94±1.24 3.19±1.68 3.56±1.50

圖3 第21天各組大鼠典型航行軌跡示意圖

3 討論

本研究從PTSD樣大鼠癥狀學(xué)的角度出發(fā)，采用國際上公認(rèn)的SPS&S模型，該模型中既有心理刺激（持續(xù)束縛）又有生理刺激（強(qiáng)制性游泳，乙醚麻醉，不可逃避的足底電擊），可使大鼠真切地體驗到生存環(huán)境中遇到的突發(fā)狀況，與人類遭遇PTSD的情形相似。電擊實驗完成后第14天，筆者依次將4組大鼠放入電擊箱中，而不做任何干預(yù)。單純應(yīng)激組大鼠所表現(xiàn)出的恐懼反應(yīng)及呆滯行為令人印象深刻，與本課題組董原君等[11]的前期研究結(jié)果相似。其中，應(yīng)激后給藥大鼠相比單純應(yīng)激大鼠的呆滯時間減少，這不禁讓筆者猜想是阿戈美拉汀消除了PTSD大鼠的部分恐懼與高警覺反應(yīng)。BANASR等[12]給正常狀態(tài)的Wistar大鼠服用阿戈美拉汀40 mg/（kg·d）3周，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)與焦慮相關(guān)的齒狀回背側(cè)和腹側(cè)細(xì)胞的增殖，提高整個齒狀回新生神經(jīng)元的存活率。在本次曠場實驗中，應(yīng)激后給藥大鼠相對單純應(yīng)激大鼠來說，穿格次數(shù)和站立次數(shù)增加，說明單純應(yīng)激大鼠的自發(fā)運動和焦慮行為得到改善。有研究對阿戈美拉汀治療的成年大鼠的腦片染色發(fā)現(xiàn)，3周后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元增生顯著增多[13]。因此阿戈美拉汀可能通過調(diào)節(jié)大鼠海馬神經(jīng)元的可塑性，來改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。HAUSCHILDT等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人們表現(xiàn)出創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙癥狀時，其記憶敏感度明顯下降。Morris水迷宮實驗可以很好地檢測大鼠與海馬功能直接聯(lián)系的空間記憶能力[15]。本實驗中，應(yīng)激后給藥大鼠在Morris水迷宮上臺潛伏期的優(yōu)秀表現(xiàn)足以說明阿戈美拉汀能有效改善SPS&S大鼠的空間記憶能力。特別需要提出的是第21天各組典型航行軌跡。經(jīng)過5 d的學(xué)習(xí)，空白對照組和單純藥物組大鼠均能自如地在水迷宮中穿梭，且不止一次地穿越平臺，各組穿臺次數(shù)無差異，其原因可能與樣本量較小有關(guān)，單純應(yīng)激組大鼠更多的是漫無目的地圍繞著水迷宮內(nèi)壁打轉(zhuǎn)，而藥物組大鼠似乎是在平臺附近努力地尋找，其特征性的表現(xiàn)為筆者下一步要進(jìn)行的分子機(jī)制研究提供了思路。

在生活中，女性罹患PTSD的概率高于男性，在臨床表現(xiàn)和預(yù)后等方面也不盡相同[16]。為排除雌性激素對實驗大鼠行為表現(xiàn)的影響，筆者僅復(fù)制了雄性動物模型，僅采用一種濃度的阿戈美拉汀，因此其最佳治療劑量也不得而知。盡管如此，本實驗仍提示，阿戈美拉汀很可能是通過調(diào)控與記憶、恐懼和焦慮相關(guān)的海馬、杏仁核及前額葉等部位的某種信號通路，來發(fā)揮治療作用。受本研究室條件限制，筆者僅從大鼠的行為表現(xiàn)方面論證了阿戈美拉汀對PTSD的預(yù)防作用，未進(jìn)一步深入探討阿戈美拉汀究竟是通過何種作用機(jī)制對PTSD的核心癥狀進(jìn)行干預(yù)的。不過可以確定的是，本實驗從行為學(xué)的角度證實應(yīng)激后早期及時給予阿戈美拉汀對預(yù)防PTSD有效。