黃 麗，孫傳孔，彭若冰，劉志明，毛甜甜，彭友儉

(武漢大學人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

敏感菌屬于一種條件致病菌，存在于機體中的口腔、胃腸道等多種部位，參與機體生態(tài)平衡的調節(jié)[1]。 近年來，臨床上因為大量使用抗生素及一些免疫抑制劑，使得患者的機體免疫力降低，機體中的菌群發(fā)生失衡，使敏感菌大量繁殖，敏感菌感染率不斷增高[2]。 相關資料顯示，敏感菌致病力與其黏附性密切相關，敏感菌感染發(fā)生的必要條件是黏附于宿主細胞上[3]。唾液對預防口腔敏感菌感染具有非常重要的作用,特別是多聚免疫球蛋白受體pIgR的胞外段——唾液中分泌片SC,可與敏感菌細胞壁外層的糖蛋白結合,在抗敏感菌感染中扮演著十分重要的黏膜免疫作用[4]。目前，有關唾液中SC對不同敏感菌黏附宿主細胞影響的研究報道尚少。本實驗通過觀察唾液中SC對臨床中常見的敏感菌S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176黏附口腔上皮細胞能力的影響,旨在為臨床深入了解敏感菌的致病性和防治提供有價值的參考。

1 實驗資料

1.1實驗材料和儀器 S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176(武漢大學菌種保存中心提供)；YEPD培養(yǎng)基(Sigma公司)；分泌片SC免疫放射試劑測定盒(上海恒遠生物科技有限公司),TRIpure總RNA提取試劑(Sigma公司)， 熒光定量 PCR 試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司)，其余試劑均為分析純。恒溫培養(yǎng)箱(北京福意電器有限公司),恒溫搖床(上海晶壇儀器制造有限公司)，PCR 儀(西安天隆科技有限公司)。

1.2敏感菌的培養(yǎng) 將S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176接種在沙堡固體的斜面培養(yǎng)基，與來源于60例健康志愿者的口腔上皮細胞(采用無菌棉簽刮取志愿者兩側的口腔頰部,采用PBS液離心洗滌3次,把口腔上皮細胞濃度調至105mL-1)進行混合培養(yǎng)。

1.3含SC及不含SC的唾液上清液制備 收集每例健康志愿者唾液3 mL,離心30 min,得到唾液上清液(即含SC的唾液上清液)。然后取上述唾液上清液各0.1 mL,滴入兔抗人SC血清0.1 mL,在37 ℃下180 r/min離心2 h,收集唾液上清液(即不含SC的唾液上清液)。采用放射免疫分析法測定上述上清液中SC濃度。

1.4黏附試驗 分別將不含SC的唾液上清液、含SC的唾液上清液與敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞混合培養(yǎng)液，在37 ℃下180 r/min離心2 h后，運用PBS液洗滌3次,重懸至0.1 mL,然后分別和相應0.1 mL的口腔上皮細胞(濃度為105mL-1)在37 ℃下 180 r/min離心2 h,實施黏附試驗操作,算出黏附率。

1.5ALS2與ALS3 mRNA表達檢測 采用熒光定量 RT-PCR法檢測。建立不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系和含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系，依據(jù)TRIpure總RNA提取試劑的說明書對培養(yǎng)液總RNA實施分離，采用紫外分光光度計測定RNA 水平，判定其純度。經(jīng)反轉錄試劑盒合成 cDNA后，實施特定引物 PCR 擴增。PCR 擴增依據(jù)張輝等[5]的方法進行。數(shù)據(jù)收集由定量 PCR 儀軟件完成，目的基因相對表達量按照如下公式進行計算:△Ct = Ct目的基因 - CtGAPDH，△Ct值越高提示目的基因相對表達量越低。

2 結 果

2.1唾液上清液中SC濃度 60例健康志愿者唾液上清液所含SC的濃度為(354.62±34.53)μg/mL,處于正常參考范圍，而滴入兔抗人SC血清進行處理過的唾液上清液中不存在SC。

2.2不同處理對口腔上皮細胞黏附率的影響 在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，3種敏感菌的黏附率分別為(34.27±2.48)%、(30.61±2.35)%、(27.73±1.63)%，S.sanguis ATCC 10556黏附率最高，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(F=19.654，P<0.05)；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，3種敏感菌的黏附率分別為(16.08±1.35)%、(20.02±1.24)%、(20.45±1.02)%，S.sanguis ATCC 10556黏附率最低，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(F=13.031，P< 0.05)；且含SC體系中，3種敏感菌的黏附率均明顯低于不含SC體系中3種敏感菌的黏附率(P均<0.05)。

2.3不同處理方式ALS2與ALS3 mRNA表達水平在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，不含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮細胞體系中ALS2 及 ALS3 mRNA表達水平最高，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮細胞體系中 ALS2 及 ALS3 mRNA 表達水平最低，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且含SC體系中，3種敏感菌的ALS2 與 ALS3 mRNA 表達水平均明顯低于不含SC體系中3種敏感菌的表達水平(P均< 0.05)。見表1。

3 討 論

唾液中的SC在抗敏感菌感染疾病中有十分重要的作用。SC是由549～558個氨基酸組成的肽鏈, 含有較多的糖基(約20%),分為5個包含100～110個氨基酸的免疫球蛋白樣結構域(D1-D5),與免疫球蛋白超家族的5個可變區(qū)有同源性[6-7]。純化的重組人游離分泌片(rSC)結構與天然SC相似, rSC的建立為進一步闡明SC的結構提供了一個良好的平臺。SC是S-IgA的重要組成部分，SC可增強S-IgA對蛋白水解酶的抵抗力，保護S-IgA的鉸鏈區(qū)，有助于S-IgA的穩(wěn)定性，使得S-IgA發(fā)揮免疫防御和穩(wěn)定內環(huán)境的重要作用，構成黏膜免疫的第一防線[8]。SC的主要功能是介導細胞內多聚免疫球蛋白的轉運和參與S-IgA的形成和分泌，直接參與非特異性免疫防御，可阻止感染的發(fā)生。目前研究證實，SC可以將黏膜上皮細胞下及固有層內的dIgA-pIgR/pIgM-pIgR復合物轉運到腔隙表面,而且SC的結合可以保護抗體使其免遭蛋白酶的降解, 從而確保SIgA在黏膜免疫防御中發(fā)揮重要作用[9]。另外pIgA與重組SC結合之后,由于保護了抗體分子的氨基酸殘基，故保護作用有所提高[10]。而在敏感菌感染疾病中,唾液中SC可與敏感菌細胞壁上的糖蛋白進行特異性結合,進而阻止敏感菌對細胞的黏附,達到黏膜免疫的目的。Lecatsas等[11]研究報道，艾滋病患者唾液中SC明顯減少,可能與其容易發(fā)生口腔細菌疾病密切相關。

表1 不同處理方式ALS2 與 ALS3 mRNA 表達水平比較

注：①與不含SC體系比較，P< 0.05。

本研究結果顯示，60例健康志愿者唾液上清液中SC濃度處于正常范圍，而滴入兔抗人SC血清進行處理過的唾液上清液中不存在SC；在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，S.sanguis ATCC 10556黏附率最高；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，S.sanguis ATCC 10556黏附率最低；且含SC體系中，3種敏感菌的黏附率均明顯低于不含SC體系中3種敏感菌的黏附率。說明唾液中SC可與敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)結合,從而阻止敏感菌對口腔上皮細胞的黏附，且唾液中SC對S.sanguis ATCC 10556抑制能力更強；另外運用兔抗人SC血清能夠中和唾液中SC,而該血清對上述敏感菌黏附口腔上皮細胞的作用沒有明顯影響。

有研究表明，ALS 家族中的ALS1～4 在念珠菌感染初期已經(jīng)存在表達[12]。 本研究發(fā)現(xiàn)，在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，不含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮細胞體系中ALS2 及 ALS3 mRNA表達水平最高；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮細胞體系中，含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮細胞體系中 ALS2 及 ALS3 mRNA 表達水平最低；且含SC體系中，3種敏感菌的ALS2 與 ALS3 mRNA 表達水平均明顯低于不含SC體系中3種敏感菌的表達水平。說明ALS2 及ALS3 mRNA高表達可能為口腔敏感菌感染致病的一個重要機制，而唾液SC能夠下調ALS2 及ALS3 mRNA表達，尤其對菌株 S.sanguis ATCC 10556作用明顯。

綜上所述，不同敏感菌的口腔上皮細胞黏附能力存在差異，菌株 S.sanguis ATCC 10556黏附能力強于S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176。唾液SC能夠抑制敏感菌對口腔上皮細胞的黏附,更易抑制菌株 S.sanguis ATCC 10556黏附口腔上皮細胞，其抑制機制可能與明顯下調 ALS2 及 ALS3 基因表達有關。