沈銀忠

摘 要 細菌內(nèi)毒素可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素血癥、膿毒性休克和彌散性血管內(nèi)凝血等。鱟試驗法是最常用的內(nèi)毒素檢測方法，其分為凝膠法和光度測定法，后者又可分為濁度法和顯色基質(zhì)法。內(nèi)毒素檢測對革蘭陰性菌感染診斷具有重要的參考價值，也用于藥品、醫(yī)療器械和環(huán)境的內(nèi)毒素監(jiān)測。內(nèi)毒素檢測對細菌感染診斷的敏感性與革蘭陰性菌的種類有關(guān)，臨床上可聯(lián)用內(nèi)毒素檢測和其他檢測手段如降鈣素原檢測來提高感染早期診斷的準確性。

關(guān)鍵詞 細菌內(nèi)毒素 鱟試驗 革蘭陰性菌感染 內(nèi)毒素血癥

中圖分類號：R446.112 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）21-0003-04

Bacterial endotoxin test and its clinical application

SHEN Yinzhong*（Department of Infection & Immunity， Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University， Shanghai 201508， China）

ABSTRACT Bacterial endotoxin can cause fever， microcirculatory disturbance， endotoxemia， septic shock and disseminated intravascular coagulation. Limulus amoebocyte lysate （LAL） assay is the main method for endotoxin detection， which can be divided into gel and photometric methods， and the latter includes turbidimetric method and chromogenic substrate method. LAL assay has an important reference value in the diagnosis of Gram-negative bacterial infection and can also be used for endotoxin test in drug， medical device and environment. The sensitivity of endotoxin test for the diagnosis of bacterial infection depends on the Gram-negative bacterial strains. Clinical endotoxin test can be used together with other tests such as procalcitonin to improve the accuracy of early diagnosis of infection.

KEy WORDS bacterial endotoxin； limulus amoebocyte lysate assay； Gram-negative bacteria infection； endotoxemia

細菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜中的一種組分，主要成分是脂多糖，后者由細菌細胞壁合成后轉(zhuǎn)運到細胞表面，細菌死亡或自溶后會從細菌細胞結(jié)構(gòu)中釋放出來。內(nèi)毒素耐熱而穩(wěn)定，抗原性弱，可刺激機體產(chǎn)生抗體（但無中和作用），形成抗毒素。內(nèi)毒素經(jīng)甲醛處理不能轉(zhuǎn)變?yōu)轭惗舅?。?nèi)毒素由O-多糖、核心多糖和類脂A組成[1]，其中類脂A是內(nèi)毒素的毒性中心。不同革蘭陰性菌的類脂A結(jié)構(gòu)基本相似，在它們所引起的感染中，內(nèi)毒素導(dǎo)致的毒性效應(yīng)也大致類同。內(nèi)毒素的毒性作用雖較弱，但可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素血癥、膿毒性休克和彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）等。內(nèi)毒素檢測對革蘭陰性菌感染診斷具有重要的參考價值，有助于早期判斷感染類型及是否存在內(nèi)毒素血癥，有利于指導(dǎo)臨床用藥及判斷患者預(yù)后[2]。對易引入內(nèi)毒素的藥品和醫(yī)療器械等，出廠前必須進行內(nèi)毒素檢測。本文介紹內(nèi)毒素檢測方法及其臨床應(yīng)用的概況。

1 內(nèi)毒素的生物學(xué)活性及對機體的影響

內(nèi)毒素是細菌生長或死亡時釋放出來的，環(huán)境中存在著大量的內(nèi)毒素。當(dāng)內(nèi)毒素通過消化道等途徑進入機體后并無危害，少量內(nèi)毒素經(jīng)注射等方式進入血液后亦可被肝臟巨噬細胞滅活，不會造成機體損害。但內(nèi)毒素大量進入血液，作為外源性致熱源作用于機體，則可使機體釋放內(nèi)源性致熱源，進而引起發(fā)熱。內(nèi)毒素大量進入并集聚于血液中還可引起不同程度的內(nèi)毒素血癥。

內(nèi)毒素血癥由細菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體所引起，在感染、嚴重創(chuàng)傷、肝功能障礙和免疫力下降等狀態(tài)時均可發(fā)生內(nèi)毒素血癥并使機體出現(xiàn)一系列的病理生理學(xué)改變[2]：①發(fā)熱；②引起組胺、5-羥色胺、前列腺素、激肽等血管活性物質(zhì)釋放，導(dǎo)致微循環(huán)擴張，靜脈回流血量減少，血壓下降，組織灌流不足、缺氧和酸中毒等；③激活補體；④激活凝血和纖溶系統(tǒng)，產(chǎn)生出血傾向和DIC；⑤直接或間接損害肝臟，引起糖和蛋白代謝改變；⑥激活巨噬細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞活性。內(nèi)毒素血癥的臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、白細胞增多或減少、出血傾向、心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、多器官功能衰竭、DIC和休克等。

自19世紀發(fā)現(xiàn)脂多糖是一種能夠引發(fā)致命性休克的革蘭陰性菌細胞壁毒素以來，人們一直在研究內(nèi)毒素在膿毒血癥發(fā)病中所起的作用。嚴重感染、膿毒血癥和多器官功能衰竭時，血漿脂多糖水平升高，但病毒感染時不升高，局灶性感染或輕微感染時一般也不升高。脂多糖不僅是膿毒性休克的誘發(fā)因素，且與動脈粥樣硬化、酒精性肝病、自身免疫性疾病、代謝綜合征、腎損傷、器官移植排異反應(yīng)、創(chuàng)傷性腦損傷、肥胖、多器官功能衰竭、抑郁癥、慢性疲勞、人獲得性免疫缺陷病毒感染和2型糖尿病等多種疾病的發(fā)生有關(guān)，臨床上發(fā)現(xiàn)這些疾病患者血漿、血清或組織中的內(nèi)毒素水平升高[3-4]。有研究顯示，慢性腎衰竭、包括血液透析患者可出現(xiàn)持續(xù)的血內(nèi)毒素水平升高，同時伴隨血促炎細胞因子如α-腫瘤壞死因子等水平升高[2]。內(nèi)毒素水平升高可能與腎衰竭患者接受血液透析時液體改道導(dǎo)致的腸道通透性改變有關(guān)，此會導(dǎo)致內(nèi)毒素轉(zhuǎn)位。血液透析后，這類患者的內(nèi)毒素水平顯著下降。

2 內(nèi)毒素的檢測方法

2.1 鱟變形細胞溶解物（limulus amoebocyte lysate， LAL）試驗

內(nèi)毒素的檢測常用家兔熱原法和LAL試驗（簡稱為“鱟試驗”）法。家兔熱原法是檢測內(nèi)毒素的第一種標(biāo)準方法，鱟試驗法則是目前最常用的內(nèi)毒素檢測方法。我國藥典收載的細菌內(nèi)毒素檢測方法為鱟試驗法，包括2種方法，即凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色基質(zhì)法。當(dāng)各種檢測法得到的檢測結(jié)果不一致時，以凝膠法的檢測結(jié)果為準。檢測過程中應(yīng)防止內(nèi)毒素污染。鱟試驗法檢測須使用鱟試劑。鱟試劑是從海洋節(jié)肢動物鱟的血液中提取其變形細胞溶解物、再經(jīng)低溫冷凍干燥制成的一種生物試劑，其因能與內(nèi)毒素和（1，3）-β-D-葡聚糖反應(yīng)形成凝膠而被廣泛用于檢測食品、水源、藥品、醫(yī)療器械以及動物和人體體液等不同樣本中的內(nèi)毒素。鱟的血液和淋巴液中有一種有核的變形細胞，這種細胞胞漿內(nèi)有大量的致密顆粒，內(nèi)含凝固酶、C-因子、B-因子和凝固蛋白原等。內(nèi)毒素與鱟試劑接觸后可激活C-因子，激活的C-因子又可激活B-因子或由（1，3）-β-D-葡聚糖激活G-因子，激活的B-或G-因子可再激活凝固酶原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槟堂?，繼而使可溶性的凝固蛋白原轉(zhuǎn)變成凝固蛋白，由此使鱟試劑變?yōu)槟z狀態(tài)[1， 3-4]。凝固酶對鱟三肽有酰氨酶活性，可使硝基苯胺游離而發(fā)生生色反應(yīng)。鱟試驗法有定性和定量之分，其按試驗方法還可進一步分為凝膠法、動態(tài)濁度法、終點濁度法、動態(tài)顯色法和終點顯色法。

凝膠法系應(yīng)用鱟試劑可與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的原理來定性或半定量檢測內(nèi)毒素的一種鱟試驗法，檢測時鱟試劑須以除熱原水（內(nèi)毒素檢查用水）復(fù)溶后使用，通過觀察有無凝膠形成作為檢測終點。凝膠法檢測操作簡便、經(jīng)濟，不需使用專用檢測設(shè)備。

動態(tài)濁度法、終點濁度法、動態(tài)顯色法和終點顯色法都是內(nèi)毒素的定量檢測方法。動態(tài)濁度法和終點濁度法都屬濁度法。濁度法是通過檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化來檢測內(nèi)毒素含量的鱟試驗法，其中動態(tài)濁度法檢測反應(yīng)混合物濁度升高至某一預(yù)先設(shè)定的吸光度時所需的時間或濁度升高的速率。動態(tài)顯色法和終點顯色法都屬顯色基質(zhì)法。顯色基質(zhì)法是通過檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物游離出生色團的多少來檢測內(nèi)毒素含量的鱟試驗法，根據(jù)產(chǎn)物色度計算內(nèi)毒素水平，又被稱為比色法。

動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法檢測都須有帶溫育系統(tǒng)的動態(tài)光度測定儀器及其配套軟件。動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法檢測操作簡便、線性范圍寬。終點顯色法檢測須有配套的酶標(biāo)儀或可見分光光度儀。

就定量檢測而言，比較同一個體內(nèi)毒素水平的變化較比較不同個體或不同方法檢測到的內(nèi)毒素水平的差異更有意義。內(nèi)毒素可被捕獲在血凝塊中，因此選用血漿樣本檢測內(nèi)毒素較選用血清樣本檢測更好（檢測時建議使用低濃度肝素）。檢測時應(yīng)防止環(huán)境內(nèi)毒素的污染。

定性鱟試驗法主要用于藥品、醫(yī)療器械等樣本的內(nèi)毒素監(jiān)測。定量鱟試驗法主要用于臨床患者的內(nèi)毒素檢測，為其臨床診治提供參考。一項研究顯示，對血液透析患者的內(nèi)毒素檢測，動態(tài)濁度法的檢測結(jié)果較顯色基質(zhì)法更為準確[5]。

（1，3）-β-D-葡聚糖是真菌細胞壁的主要組分，鱟試劑中含有對其敏感的G-因子和會轉(zhuǎn)變并形成凝膠的凝固蛋白原。使用鱟試劑檢測（1，3）-β-D-葡聚糖的試驗被稱為G-試驗，臨床上用于侵襲性真菌感染的早期診斷。

2.2 替代檢測方法

鱟是珍稀動物，保護力度越來越大。因此，研發(fā)鱟試驗的替代方法成為當(dāng)務(wù)之急。替代方法主要有蛋白染色法、熒光偏振法、同位素標(biāo)記法和酶聯(lián)免疫測定法等。不過，這些替代方法的臨床應(yīng)用價值仍待進一步研究或確認，目前臨床上應(yīng)用最多的依然是鱟試驗法。

3 內(nèi)毒素檢測的應(yīng)用

3.1 內(nèi)毒素檢測在疾病診治中的應(yīng)用

血漿內(nèi)毒素可來源于感染的局部組織、血液、胃腸道或呼吸道、或食物及其他攝入物中的細菌。血液中的內(nèi)毒素通常歸因于從胃腸道轉(zhuǎn)位而來的脂多糖，胃腸道中的革蘭陰性菌可產(chǎn)生大量的脂多糖并進入血液。內(nèi)毒素與多種感染性疾病密切相關(guān)，是革蘭陰性菌感染的重要標(biāo)志。內(nèi)毒素檢測既可用于感染的鑒別診斷，也可用于監(jiān)測炎癥活動，在重癥醫(yī)學(xué)科、感染科、血液科、燒傷科、呼吸科、消化科、急診科、透析科、婦產(chǎn)科、小兒科和腫瘤科等臨床科室中得到廣泛應(yīng)用。

內(nèi)毒素檢測在臨床上主要用于感染性疾病、尤其是革蘭陰性菌感染的診斷，可幫助臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物。內(nèi)毒素水平升高提示細菌感染可能，非細菌感染性疾病患者的內(nèi)毒素水平往往并不升高，病毒感染性疾病患者的內(nèi)毒素水平也不升高。內(nèi)毒素檢測在臨床上較多用于膿毒血癥的輔助診斷。膿毒血癥和膿毒性休克患者常有內(nèi)毒素水平急劇升高的表現(xiàn)。一項研究顯示，內(nèi)毒素檢測在診斷革蘭陰性菌感染上的敏感性達85.3%，排除革蘭陰性菌感染的陰性預(yù)測值為98.6%，排除感染的陰性預(yù)測值為94.8%[6]。不過，一項薈萃分析卻顯示，在銅綠假單胞菌和變形桿菌所致菌血癥患者中，內(nèi)毒素血癥的陽性率分別為69%和76%，均高于無菌血癥患者；但在大腸埃希菌所致菌血癥患者中，內(nèi)毒素血癥的陽性率只有57%[7]。內(nèi)毒素血癥與革蘭陰性菌菌血癥之間的一致性與細菌種類有關(guān)，其中在大腸埃希菌所致菌血癥中，這種一致性較差。此研究結(jié)果提示，內(nèi)毒素檢測對革蘭陰性菌菌血癥的診斷價值與細菌種類有關(guān)，內(nèi)毒素檢測結(jié)果與革蘭陰性菌菌血癥診斷之間的一致性偏低。總體來說，內(nèi)毒素血癥的檢出并不能準確鑒別革蘭陰性菌感染或菌血癥，其對排除革蘭陰性菌感染或菌血癥的價值可能更大[2]。有研究表明，慢性炎癥性腸病、肝病和慢性代謝性疾病如肥胖、糖尿病等患者均可出現(xiàn)內(nèi)毒素水平升高現(xiàn)象[4]。需注意的是，內(nèi)毒素檢測結(jié)果陰性并不完全排除基礎(chǔ)疾病可致內(nèi)毒素水平異常，而高水平的內(nèi)毒素也不一定反映患者疾病的嚴重性。需注意的還有，某些情況如免疫球蛋白治療后可引起內(nèi)毒素檢測結(jié)果呈假陽性。盡管有這些局限性，鱟試驗法仍是評估革蘭陰性菌感染的有價值的工具。降鈣素原檢測常用于判斷有無感染可能，臨床上聯(lián)用內(nèi)毒素和降鈣素原檢測有助于感染性疾病的早期診斷。

內(nèi)毒素檢測也常用于監(jiān)測存在嚴重感染風(fēng)險的患者，這類患者主要包括：免疫缺陷如器官移植后、艾滋病和長期服用免疫抑制劑的患者；重癥醫(yī)學(xué)科患者；重大手術(shù)后患者等。內(nèi)毒素在膿毒血癥和全身嚴重細菌感染時才會被釋放，因此內(nèi)毒素檢測可用于監(jiān)測嚴重感染的發(fā)生。有研究顯示，接受心臟手術(shù)和嚴重創(chuàng)傷的患者也可出現(xiàn)內(nèi)毒素水平升高，其原因可能與低灌注導(dǎo)致的腸道損傷使得脂多糖轉(zhuǎn)位進入血液循環(huán)有關(guān)[8]。對重癥醫(yī)學(xué)科患者，臨床上懷疑感染卻無微生物學(xué)證據(jù)時，內(nèi)毒素檢測可幫助監(jiān)測患者是否存在感染可能，對指導(dǎo)抗菌藥物的使用具有極為重要的作用[8]。

內(nèi)毒素檢測還可用于評估疾病進展和患者預(yù)后[2]。內(nèi)毒素水平升高是炎癥活動性的反映。疾病惡化往往伴隨內(nèi)毒素水平升高，疾病緩解也常伴隨內(nèi)毒素水平降低。內(nèi)毒素水平持續(xù)升高常提示患者預(yù)后不良。研究顯示，高內(nèi)毒素水平會提高嚴重膿毒血癥發(fā)生的風(fēng)險和重癥醫(yī)學(xué)科患者的病死率[8]。薈萃分析也發(fā)現(xiàn)，對非重癥醫(yī)學(xué)科患者，革蘭陰性菌菌血癥和內(nèi)毒素血癥是病死率升高的預(yù)測因素[9]。內(nèi)毒素血癥對革蘭陰性菌菌血癥患者病死率的預(yù)測價值與細菌種類有關(guān)，可預(yù)測非大腸埃希菌腸桿菌科細菌感染患者的病死率，但不能用于預(yù)測大腸埃希菌感染患者的病死率[10]。

3.2 內(nèi)毒素檢測在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

內(nèi)毒素檢測還常用于注射用藥品、醫(yī)療器械以及環(huán)境的內(nèi)毒素監(jiān)測。

4 內(nèi)毒素檢測的局限性

內(nèi)毒素檢測也存在很多局限性[3]，例如：內(nèi)毒素檢測方法多種多樣，檢測結(jié)果之間可能存在很大的差異；脂多糖的結(jié)構(gòu)、溶解度等物理性質(zhì)以及生物活性都存在很大的異質(zhì)性，如何解讀內(nèi)毒素檢測結(jié)果也一直存在不同的觀點；脂多糖在有些革蘭陽性菌感染患者體內(nèi)也能檢出，但在有些革蘭陰性菌感染患者中卻不能檢出；血漿內(nèi)毒素水平與炎性標(biāo)志物水平或代謝指標(biāo)值變化之間的關(guān)系并不確定?；颊邩颖局写嬖诘囊恍┪镔|(zhì)可能會影響內(nèi)毒素檢測的準確性。樣本采集過程中防止內(nèi)毒素污染亦至關(guān)重要。此外，內(nèi)毒素檢測結(jié)果可因所用檢測試劑生產(chǎn)廠家及其生產(chǎn)批次的不同而出現(xiàn)差異。

根據(jù)鱟試驗法原理可知，鱟試劑與脂多糖和（1，3）-β-D-葡聚糖都可發(fā)生反應(yīng)而使檢測結(jié)果呈陽性，即鱟試驗法用于內(nèi)毒素檢測存在假陽性結(jié)果的可能[4， 11]。長期接受血液透析治療患者的內(nèi)毒素檢測陽性率高，其中就可能包括因受（1，3）-β-D-葡聚糖影響而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。使用去G-因子的鱟試劑可提高內(nèi)毒素檢測的準確性。

文獻分析結(jié)果顯示，內(nèi)毒素檢測用于細菌感染診斷的敏感性與革蘭陰性菌的種類有關(guān)，其中用于銅綠假單胞菌感染診斷的敏感性通常高于腸桿菌科細菌如大腸埃希菌感染診斷的敏感性[4]。

5 小結(jié)

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜中存在的一類具有廣泛生物活性的物質(zhì)，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素血癥、膿毒性休克和DIC等。內(nèi)毒素檢測主要通過鱟試驗法來進行，分為凝膠法和光度測定法，后者又分為濁度法和顯色基質(zhì)法。內(nèi)毒素檢測對革蘭陰性菌感染診斷具有重要的參考價值，可幫助早期判斷感染類型及是否存在內(nèi)毒素血癥，有利于指導(dǎo)臨床用藥及判斷患者預(yù)后。內(nèi)毒素檢測也常用于注射用藥品、醫(yī)療器械以及環(huán)境的內(nèi)毒素監(jiān)測。內(nèi)毒素檢測對細菌感染診斷的敏感性與革蘭陰性菌的種類有關(guān)，臨床上可聯(lián)用內(nèi)毒素檢測和其他檢測手段如降鈣素原檢測來提高感染早期診斷的準確性。內(nèi)毒素檢測方法多種多樣，檢測結(jié)果之間可能出現(xiàn)很大的差異，檢測結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合患者病情作綜合分析。基于已有的研究數(shù)據(jù)，目前并不推薦對患者常規(guī)進行內(nèi)毒素檢測。

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