許冠華 沈麗君 劉紅勝 吳逢選 王云超?

惡性腫瘤已成為導致全球人口死亡的主要原因之一?；煘槟[瘤最常用的方法之一，但化療缺乏特定靶向性，免疫功能抑制是其中一個重要的不良反應。而機體免疫功能對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起重要作用［1］，免疫功能低下，可間接導致腫瘤的復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，降低患者的生活質(zhì)量和生存率。隱丹參酮為從丹參中提取的二萜醌類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、心血管保護、抑菌功效［2-3］，前期研究表明隱丹參酮具有明顯的抑制腫瘤細胞增殖的作用，同時具有增效順鉑、阿霉素抗實體腫瘤的作用［4-5］。2017年3月至8月作者通過實驗研究探討隱丹參酮對于荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、T細胞增殖數(shù)量、T細胞亞群比例及對血清細胞因子IFN-γ、IL-2的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 隱丹參酮購自成都曼思特生物科技有限公司（批號：MUST-11081109）；順鉑購自德州德藥有限公司（批號：130303）；胎牛血清購自Gibco公司（批號：10437-028）；0.25%胰蛋白酶購自HyClone公司（型號：SH30042.01）；ELISA試劑盒購自浙江寶成生物科技有限公司。

1.2 細胞與動物 PC9細胞由浙江省中醫(yī)院中心實驗室饋贈；4～6周齡SPF 級BALB/c小鼠由浙江中醫(yī)藥大學動物研究中心購自上海斯萊克公司，雌雄小鼠各20只，體重16～20g，全部小鼠適應性喂養(yǎng)7d，室溫22～26℃，相對濕度40%～60%，明暗交替12h，自由飲水、采食。動物飼養(yǎng)室保持安靜，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.3 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；超凈工作臺，蘇州精華設備公司；多功能全波長酶標儀，Thermo公司；超低溫冰箱，SANYO；流式細胞儀，BD公司；倒置顯微鏡，奧林巴斯公司；微量移液器，BD公司；低溫冷凍離心機，Sigma 公司。

1.4 方法 （1）細胞培養(yǎng)：PC9細胞復蘇后以2×106/ml密度接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，細胞在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞生長至80%～90%時用0.1%胰酶消化并按照1：3傳代，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的PC9細胞用于實驗。（2）荷瘤小鼠動物模型的建立與分組：接種PC9細胞前1d，剃去小鼠待接種區(qū)域（1cm×1cm）的毛。取對數(shù)生長期的PC9肺腺癌細胞，經(jīng)胰酶消化后，用PBS 調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，在小鼠右側(cè)腋下接種腫瘤細胞0.1 ml（約合每只小鼠105細胞），接種完成后，當瘤塊長至100mm3（接種后第7天左右）時，隨機分為空白對照組、模型組、CPT組、DDP組及DDP聯(lián)合用藥組。（3）給藥的劑量及方法：隱丹參組 100mg/（kg·d），DDP 組為 2mg/（kg·次），聯(lián)合用藥組 100mg/（kg·d）CPT+2mg/（kg·次）DDP，隱丹參酮連續(xù)給藥15d，順鉑給藥2次/周（每周第1、4天），正常小鼠作為對照組、模型組每日注射同體積的生理鹽水，最后一次給藥結(jié)束后行相關(guān)指標的檢測工作。（4）檢測相關(guān)實驗指標：①隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響：小鼠脫臼處死，以無菌操作取下脾臟，生理鹽水沖洗，去除筋膜，用濾紙吸干殘血后，電子天平稱質(zhì)量并計算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/小鼠體重（g）×10。②CCK8法檢測隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠T 細胞增殖的影響：停止用藥24h后處死小鼠，無菌條件下取脾，制備脾細胞懸液，臺盼藍計數(shù)活細胞＞95%。用完全RPMI 1640培養(yǎng)液將脾細胞懸液調(diào)配成細胞濃度2×106/ml的單細胞懸液。取已制備的脾細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，每個樣本做6個孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。于實驗終止前每孔加入CCK8試劑200μl，振蕩器上振蕩10min，酶標儀于570nm波長測定吸光度。細胞增殖率（%）=實驗組平均吸光度/對照組平均吸光度×100%。③流式細胞術(shù)檢測隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠T細胞亞群的影響：取100μl已制備的脾淋巴細胞懸液于EP 管中，4℃、1000r/min離心5min，加入冷PBS 1ml，離心、棄上清液，加冷凍PBS 100μl，并按說明加入PE-Cy7-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD4、PE -抗小鼠CD8，4℃避光孵育30min，加入PBS 1ml，離心、棄上清液，加入500μl PBS，流式細胞儀檢測。④ ELISA檢測隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響：末次給藥后24h，小鼠球后靜脈叢采血，每只取血0. 8～1 ml，分離血清。實驗組均設5個復孔。將每個標準品及標本的吸光值減去空白孔的吸光值，繪制標準曲線，通過標本的吸光值在曲線上查出其對應濃度。IL-2/IFN-γ（μg/L）=標準曲線上查出的濃度× 稀釋倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響 見表1。

表1 隱丹參酮對荷瘤小鼠化療后脾臟重量、指數(shù)影響（）

表1 隱丹參酮對荷瘤小鼠化療后脾臟重量、指數(shù)影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與隱丹參酮組比較，ΔP＜0.01，與順鉑組比較，*P＜0.01

組別 n（只） 脾臟重量（mg） 脾臟指數(shù)模型組 8 74.69±6.51* 2.02±0.99*隱丹參酮組 8 89.60±9.04# 2.87±1.22#順鉑組 8 53.87±4.66#Δ 1.76±0.57#Δ聯(lián)合用藥組 8 84.52±7.39▲ 2.76±0.54▲對照組 8 118.77±10.04 3.66±1.54

3.2 隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠T細胞增殖的影響 見表2。

表2 隱丹參酮對荷瘤小鼠T細胞增殖的影響（）

表2 隱丹參酮對荷瘤小鼠T細胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與順鉑組比較，ΔP＜0.05

組別 n（只） T細胞增殖率（%）模型組 8 74.76±10.54*隱丹參酮組 8 86.05±6.70#順鉑組 8 51.53±4.38#聯(lián)合用藥組 8 62.74±7.74Δ對照組 8 100.00

2.3 流式細胞術(shù)檢測隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠T 細胞亞群的影響 見表3。

表3 隱丹參酮對荷瘤小鼠化療后T細胞亞群的影響（）

表3 隱丹參酮對荷瘤小鼠化療后T細胞亞群的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與順鉑組比較，ΔP＜0.05

組別 n(只) CD3+T CD3+CD4+T CD3+CD8+T CD4+/CD8+T NK細胞模型組 8 15.25±2.50* 13.02±0.99*12.02±0.99*1.12±0.99 1.38±0.99*隱丹參酮組 8 19.59±1.22#Δ 12.87±1.22 15.87±1.22#1.11±1.22 1.69±1.22#Δ順鉑組 8 11.48±0.57# 13.06±0.57 11.85±0.57 1.09±0.57 1.16±0.57#聯(lián)合用藥組 8 17.76±0.54Δ 12.76±0.54 12.01±0.54 1.10±0.54 1.54±0.54Δ對照組 8 26.54±4.26 18.52±1.54 17.66±1.54 1.16±1.54 1.98±1.54

2.4 ELISA 檢測隱丹參酮對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2 的影響 見表4。

表4 隱丹參酮對荷瘤小鼠化療后IFN-γ、IL-2的影響（）

表4 隱丹參酮對荷瘤小鼠化療后IFN-γ、IL-2的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與順鉑組比較，ΔP＜0.05；與隱丹參酮組比較，▲P＜0.01

組別 n(只) IFN-γ IL-2模型組 8 9.58±1.05* 1.65±0.53*隱丹參酮組 8 14.09±2.05#Δ 2.07±0.59#Δ順鉑組 8 6.49±0.83# 1.09±0.09#聯(lián)合用藥組 8 11.45±2.06Δ▲ 1.89±0.29Δ對照組 8 20.55±3.65 2.79±0.58

3 討論

惡性腫瘤是目前嚴重危害人類健康的疾病，化療是臨床應用最廣泛的治療手段，化療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常組織細胞也具有強大的抑制作用，對機體的免疫功能也具有全面抑制作用，使機體免疫功能低下。T 細胞介導的細胞免疫功能低下在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，T 細胞的狀況反映機體抗腫瘤的能力，而NK細胞是抗腫瘤的重要效應細胞，其不僅可以直接殺傷腫瘤細胞，也可以通過產(chǎn)生IL-2、干擾素等增強其他細胞的抗腫瘤作用［6］。

隱丹參酮作為丹參酮類化合物中重要的組成成分之一，在抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病、抗缺血再灌注損傷及抗血小板聚集等方面顯示出諸多藥理活性［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮具有抗惡性腫瘤細胞、協(xié)同化療藥物抗惡性腫瘤細胞的作用，游艷等［8］研究表明：隱丹參酮可增強巨噬細胞吞噬功能及誘導巨噬細胞向M2 型分化，張雷等［9］研究表明隱丹參酮具有對正膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠異常的免疫功能改善作用。

IFN-γ主要由單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及造血細胞等產(chǎn)生，這些細胞受到病毒、細菌、內(nèi)毒素、原蟲等刺激產(chǎn)生IFN，臨床上主要用于抗病毒感染和抗腫瘤生物制品。而IL-2可促進活化B細胞增殖，為調(diào)控免疫應答的重要因子，也參與抗體反應、造血和腫瘤監(jiān)視。本實驗研究表明，隱丹參酮具有增強荷瘤小鼠免疫功能的作用，主要機制與增強IFN-γ、IL-2的表達，進而促進T細胞亞群中CD3+、NK細胞表達，而NK細胞表達的增加與隱丹參酮抗腫瘤密切相關(guān)，CD3+表達的增強與腫瘤化療預后密切相關(guān)。對于腫瘤患者而言，抗腫瘤及改善腫瘤患者免疫功能皆具有十分重要的作用，且兩者可起到相互輔佐的作用，對于提高腫瘤患者生存周期、明顯改善生活質(zhì)量具有積極的作用。

本動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組免疫功能受到明顯的抑制，細胞毒藥物的應用，使荷瘤小鼠的免疫功能更是雪上加霜，隱丹參酮為傳統(tǒng)中草藥丹參中的提取物，丹參素來有“一味丹參，功同四物”的神奇功效，應用隱丹參酮后，荷瘤小鼠的免疫功能明顯改善，本實驗某種程度上為丹參具有提高腫瘤患者免疫力的作用提供了依據(jù)。但是，本實驗僅為單一次移值瘤動物模型，單一實驗中心數(shù)據(jù)，仍需我團隊科研人員對其他細胞株移值瘤動物模型或其他種群模型進行反復試驗，為隱丹參酮服務于臨床提供有效、足量的數(shù)據(jù)支撐。