朱寧 韓睿 程浩?

鮑溫樣丘疹?。˙P）臨床表現(xiàn)為青壯年外生殖器部位多發(fā)色素性扁平丘疹，組織病理呈低度惡性原位鱗癌表現(xiàn)，本病的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)與人乳頭瘤病毒（HPV）尤其是與HPV16、18等高危型感染有關(guān)。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）作為機體重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，通過其選擇性高表達的Toll樣受體7和9（TLR7和TLR9）識別病毒核酸，引起pDC活化、IFN-α和其他炎癥性細(xì)胞因子的分泌并激活其他類型免疫細(xì)胞，從而起到抗病毒感染的作用［1］。研究顯示［2］BP患者皮損處存在免疫抑制狀態(tài)，特別是局部細(xì)胞免疫受抑制，造成一系列免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的數(shù)量和功能異常有關(guān)，但具體機制尚未完全闡明。本文探討pDC和TLR7、TLR9在BP病毒免疫方面發(fā)揮的作用，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2008年7月至2013年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院36例BP患者的皮損蠟塊，均符合BP臨床診斷并經(jīng)組織病理確診。其中男26例，女10例；年齡21～64歲，平均年齡（33.06±10.38）歲。病程1個月～3年，平均（7.33±8.00）個月。男性皮損部位包括龜頭、冠狀溝、包皮、陰莖、陰囊；女性皮損部位包括會陰、肛周、陰道口、大小陰唇等。所有病例均排除自身免疫性疾病、病毒性肝炎、結(jié)核及糖尿病等可能影響機體免疫力的疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院和學(xué)校倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 鼠抗人CD123單克隆抗體、兔抗人TLR7多克隆抗體、兔抗人TLR9多克隆抗體（均購自美國Santa Cruz公司），即用型UltraSensitivTM S-P免疫組化試劑盒、二抗（生物素標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔）、DAB酶底物顯色劑（均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法 （1）CD123、TLR7、TLR9的免疫組化染色：分別取36例BP患者局部皮損和皮損旁正常皮膚組織，標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚度為4 μm。采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶法（SP法），按照試劑盒說明書操作，常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，依次滴加過氧化物酶阻斷劑，封閉血清，分別用鼠抗人CD123單克隆抗體、兔抗人TLR7多克隆抗體、兔抗人TLR9多克隆抗體進行免疫組化染色，以PBS代替一抗作為陰性對照，一抗工作液稀釋濃度為1：100，生物素標(biāo)記的二抗，鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染并封片，光鏡下觀察并判定結(jié)果。（2）免疫組化染色結(jié)果判定：①CD123+pDC的表達及計數(shù)［3］：10×40倍光鏡下觀察，表皮、真皮內(nèi)以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜著色呈褐色并有樹突狀突起的細(xì)胞為CD1a+LC、CD123+pDC，每張切片隨機選取表皮、真皮乳頭層為主的5個視野計數(shù)CD1a+LC、CD123+pDC細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，CD1a+LC、CD123+pDC密度=5個視野CD1a+LC、CD123+pDC細(xì)胞總數(shù)/5個視野總細(xì)胞數(shù)。②TLR7、TLR9的表達及半定量計分［4］：10×40倍光鏡下觀察，以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜有棕褐色到淡黃色顆粒著色者為TLR7、TLR9陽性細(xì)胞，表達強度采用基于染色強度和陽性細(xì)胞百分率的半定量計分法：染色強度計分（A）：3分：棕褐色；2分：棕黃色；1分：淡黃色；0分：未著色；陽性細(xì)胞百分率計分（B）：3分：＞66%的表皮細(xì)胞著色；2分：33%～66%的表皮細(xì)胞著色；1分：＜33%的表皮細(xì)胞著色，TLR7、TLR9的表達強度為：A×B。每張切片隨機選取5個視野進行陽性細(xì)胞觀察并予以半定量計分，取平均值作為10×40倍光鏡下每個視野內(nèi)TLR7、TLR9表達半定量計分的平均結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BP皮損組織中CD123+pDC的分布與密度 CD123分子主要表達于真皮乳頭層的單核細(xì)胞，為棕褐色胞漿著色的樹突狀細(xì)胞，結(jié)果見圖1。BP皮損真皮乳頭層中CD123+pDC密度（0.351±0.107）比皮損旁正常皮膚真皮乳頭CD123+pDC密度（0.232±0.111）明顯增多（P＜0.01），且體積較大，呈多角形，見表1。

圖1 CD123+pDC在BP皮損組織和皮損旁正常皮膚組織中的分布與密度（SP×400）

表1 BP皮損組織和皮損旁正常皮膚組織中CD123+pDC的表達比較

2.2 BP皮損組織中TLR7的表達 TLR7在真皮上部表達較強，主要位于胞漿。TLR7在BP皮損真皮內(nèi)表達強度明顯高于皮損旁正常皮膚組織真皮內(nèi)［（5.083±2.285）vs.（3.611±1.498），P＜0.01］，見圖 2、表2。

圖2 TLR7在BP皮損組織和皮損旁正常皮膚組織中的表達（SP×400）

表2 BP皮損和皮損旁正常皮膚的真皮組織、表皮組織中TLR7、TLR9的表達比較

圖3 TLR9在BP皮損組織和皮損旁正常皮膚組織中的表達（SP×400）

2.3 BP皮損組織中TLR9的表達 TLR9主要定位于細(xì)胞的胞漿，以真皮上部為主（4.639±2.072），結(jié)果見圖3。TLR9在BP皮損真皮內(nèi)表達強度明顯高于皮損旁正常皮膚組織真皮內(nèi)［（3.278±1.137），P＜0.01］，見表2。

2.4 BP皮損CD123+pDC細(xì)胞密度與TLR7、TLR9表達的相關(guān)性分析 BP皮損組織中CD123+pDC細(xì)胞密度較高，皮損真皮中TLR7、TLR9高表達，皮損組織中CD123+pDC密度與皮損真皮中TLR7表達水平及與TLR9表達水平間均呈直線正相關(guān)關(guān)系（前者r=0.617，P=0.000；后者 r=0.505，P=0.002），見圖 4A、B。在BP皮損旁正常皮膚組織中CD123+pDC細(xì)胞密度較低，皮損旁正常皮膚組織真皮中TLR7、TLR9低表達，皮損旁正常皮膚組織中CD123+pDC密度與皮損旁正常皮膚組織真皮中TLR7及與TLR9之間均呈直線正相關(guān)關(guān)系（前者r=0.617，P=0.000；后者r=0.522，P=0.001）。

3 討論

pDC是機體免疫系統(tǒng)在抗病毒感染過程中主要產(chǎn)生IFN-α的細(xì)胞，能夠?qū)Χ喾N病毒感染作出應(yīng)答。人類較多病毒性疾病均存在不同程度的pDC數(shù)量和功能改變，但不同的研究結(jié)果存在一定的爭議。

目前國內(nèi)外關(guān)于HPV感染相關(guān)的疾病中pDC的免疫作用和地位研究報道甚少，特別在與高危型HPV16、18感染關(guān)系密切的BP的發(fā)病機制中pDC的作用地位還未見報道。Zhu Xiaoxia等［3］報道尖銳濕疣患者皮損中CD2AP+pDC、CD123+pDC的密度和陽性率均比對照組邊緣正常組織高。Van Seters等［5］報道HPV（+）的外陰上皮內(nèi)瘤變（VIN）患者冷凍切片中pDC的數(shù)量增加。Bontkes HJ等［6］報道83%的HPV感染相關(guān)宮頸癌患者的冷凍切片中有pDC存在，pDC表達的HPV16病毒衣殼VLP受體—CD49f，與HPV16 VLP共培養(yǎng)分泌IFN-α，提示HPV16 VLP可通過誘導(dǎo)pDC分泌IFN-α來發(fā)揮抗病毒的免疫功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD123+pDC在BP皮損組織中的密度較皮損旁正常組織中增高，細(xì)胞胞體較大。因此推測pDC可能參與了BP皮損中抗HPV感染的免疫反應(yīng)，但BP易反復(fù)不愈的臨床現(xiàn)狀提示皮損中pDC雖然密度增加但可能未能建立有效的免疫應(yīng)答。

TLR作為一種天然免疫模式識別受體，通過與相關(guān)病原分子結(jié)合，引發(fā)一系列細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥介質(zhì)的釋放，在機體誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)天然免疫以及獲得性免疫過程中發(fā)揮重要作用。pDC高表達TLR7和TLR9［7］，TLR7主要識別病毒ssRNA，TLR9主要識別病毒CpG-ODN片段，可通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴或非依賴途徑，活化核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）或干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）家族（IRF-3、5、7），進而調(diào)節(jié)一系列炎癥性細(xì)胞因子，最終影響pDC產(chǎn)生大量的 IFN-α，從而產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)［8］。Daud II等［9］研究顯示在HPV16感染的宮頸上皮中，TLR7、TLR9的表達升高及相關(guān)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)對于HPV16病毒的清除具有重要作用。Cannella F等［10］研究顯示TLR9在HPV感染的宮頸黏膜中表達升高，在HPV的持續(xù)感染者TLR9的表達更高，HPV 16可以影響TLR9的轉(zhuǎn)錄，TLR9的升高如未能使HPV得以清除有可能提示患者向?qū)m頸癌發(fā)展的可能性大。本研究結(jié)果顯示，BP皮損真皮中TLR7和TLR9染色均較深，表達強度高于相應(yīng)皮損旁正常真皮，與上述Daud II及Cannella F等研究報道的在HPV感染相關(guān)病變組織中TLR7、TLR9表達升高結(jié)果一致。推測HPV感染后局部皮損組織處于高水平免疫激活狀態(tài)，盡管TLR7和TLR9在參與機體識別HPV或在抗病毒免疫應(yīng)答、抑制HPV免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，但可能未能扭轉(zhuǎn)其他機制所致的局部免疫功能低下，而導(dǎo)致HPV感染呈持續(xù)狀態(tài)。

Pearson相關(guān)性分析顯示，BP皮損及皮損旁正常組織中，pDC細(xì)胞密度與真皮中TLR7表達強度之間、pDC細(xì)胞密度與真皮中TLR9表達強度之間均存在直線正相關(guān)，提示BP皮損真皮中TLR7和TLR9的表達升高可能與皮損局部pDC密度增高有關(guān)，由此推測BP皮損局部pDC未能發(fā)揮有效的細(xì)胞免疫功能可能不是因為pDC未能充分表達TLR7和TLR9的原因而造成，但具體原因尚需進一步研究闡明。