金美芳，林茂茲,3*，陳春香，雷曉玲

(1.福建師范大學(xué)福清分校近海流域環(huán)境測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福清350300；2.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300；3.武夷學(xué)院福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建武夷山354300)

植物枯萎病一般由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)侵染引起[1]，是一種世界性土傳真菌病害，其發(fā)病機(jī)理是：致病菌侵害莖基部維管束后，在維管束內(nèi)繁殖蔓延，通過(guò)堵塞維管束導(dǎo)管和分泌有毒物質(zhì)毒害寄主細(xì)胞，破壞寄主正常吸收輸導(dǎo)機(jī)能，使寄主的養(yǎng)分水分轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，最終造成植株枯死[2-4]?？菸≡谥仓甑娜诰砂l(fā)生，對(duì)生產(chǎn)造了成巨大損失，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的被嚴(yán)重危害的作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黃瓜、哈密瓜、西瓜、大豆、豇豆和太子參等[1-3]。植物枯萎病主要防治方法有培育抗性品種、化學(xué)試劑、采取農(nóng)業(yè)措施、生物防治等方法。由于枯萎病由土傳性真菌引起，情況復(fù)雜，用生物防治是一種較好的辦法[2,4-6]。目前已報(bào)道用于防治尖孢鐮刀菌引起枯萎病的主要有淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilies)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)[2]、木霉菌(Trichoderma)[7-10]、多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)[4-5,11-13]等。叢枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalFungi)對(duì)防治尖孢鐮刀菌引起的枯萎病也有較好的抑制作用[14]。盆栽試驗(yàn)表明，多粘類(lèi)芽孢桿菌BRF-1和枯草芽孢桿菌BRF-2菌懸液及其無(wú)菌代謝物對(duì)黃瓜和番茄枯萎病不僅具有較好的防治效果，而且具有明顯的促生作用[12]。生防菌EN5可以在其自然寄主番茄的根、莖及根際土壤中穩(wěn)定定殖，有助于改善根際土壤微生態(tài)環(huán)境，抑制病菌繁殖[15]。研究尖孢鐮刀菌引起的枯萎病生防菌對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，對(duì)生物菌肥開(kāi)發(fā)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要的意義。

番茄(Lycopersiconesculentum)，別名西紅柿、洋柿子，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，可以生食、煮食、加工制成番茄醬、汁或整果罐藏，是全世界栽培最為普遍的果菜之一。番茄種植中番茄青枯病(枯萎病)是常見(jiàn)的病害之一，各地普遍發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)造成植株青枯死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收[11-13,15-18]。番茄病的生物防治效果及防治機(jī)理研究受到廣泛關(guān)注[13,15-18]。本文以易感染尖孢鐮刀菌引起枯萎病的番茄植株為材料，用前期篩選鑒定的多粘類(lèi)芽孢桿菌S960[4-5]，在番茄幼苗期多次灌根，通過(guò)測(cè)定番茄植株的相關(guān)生長(zhǎng)生理指標(biāo)，研究生防菌S960對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響，為生物菌肥開(kāi)發(fā)提供一定的理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

多粘類(lèi)芽孢桿菌S960：福建師范大學(xué)福清分校環(huán)境保護(hù)研究所保存。

番茄種子：以色列2012 F1號(hào)，購(gòu)自濟(jì)南沃爾富斯農(nóng)業(yè)科技有限公司。

培養(yǎng)基：用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)多粘類(lèi)芽孢桿菌S960，配方為：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 多粘類(lèi)芽孢桿菌的培養(yǎng) 將S960菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基活化后，在無(wú)菌條件下將其接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于30 ℃搖床，振蕩培養(yǎng)48 h，待細(xì)菌濃度達(dá)到108cfu/mL備用。

1.2.2 番茄的培養(yǎng)與處理 番茄的培養(yǎng)與處理在福建師范大學(xué)福清分校后山大棚中進(jìn)行。將番茄種子播于營(yíng)養(yǎng)土中(穴盤(pán))，每穴1粒種子，正常管理，待番茄幼苗長(zhǎng)到4～5片真葉時(shí)，取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗120株移栽到含有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，1周后，用自來(lái)水將多粘類(lèi)芽孢桿菌稀釋為0(3.55×108cfu/mL，T1)、0.5(7.1×107cfu/mL，T2)、10(3.55×107cfu/mL，T3)、50(7.1×106cfu/mL，T3)、100(3.55×106cfu/mL，T4)、500(7.1×105cfu/mL，T6)倍進(jìn)行灌根處理。用自來(lái)水灌根作為空白對(duì)照(CK)。每個(gè)濃度排成1列，各處理15株，每隔1周灌根1次，連續(xù)灌根4次。試驗(yàn)期間保持常溫(約25～30 ℃)，正常日照，正常濕度(60%～70%)。移栽1周后用1/4濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌1次以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 第4次灌根7 d后，對(duì)番茄進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。方法如下：

番茄生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定：番茄的株高、枯萎高度占株高比例、莖周長(zhǎng)、地上生物量(干質(zhì)量)、根干質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)參考文獻(xiàn)[19]的方法，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定重復(fù)5次。

光合作用指標(biāo)的測(cè)定：用Ciras-2光合作用測(cè)定儀(美國(guó)，PP systems)測(cè)定番茄倒數(shù)第4片葉片的凈光合速率(PN)、氣孔導(dǎo)度(gs)、細(xì)胞間二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(E)等氣體交換參數(shù)。每個(gè)處理隨機(jī)重復(fù)10次測(cè)定。

葉綠素含量的測(cè)定：采樣丙酮提取法[20]，提取液在645 nm、663 nm波長(zhǎng)下用UV-1801紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京，北分瑞利公司)測(cè)定吸光值。測(cè)定時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)挑選3株番茄，分別取倒數(shù)第4片葉片各約1 g進(jìn)行測(cè)定。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定：用Handy-PEA植物效率分析儀(英國(guó)，Hansatech)測(cè)定番茄倒數(shù)第4片葉片的PIabs、Fv/Fm、ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC、DI0/RC、φP0、ψE0、φE0、DFabs等參數(shù)。每處理隨機(jī)重復(fù)10次測(cè)定。每測(cè)定前活體植株葉片暗適應(yīng)30 min。

取倒數(shù)第4片葉片，測(cè)定可溶性蛋白、可溶性糖和丙二醛含量?？扇苄缘鞍缀坑每捡R斯亮藍(lán)染色法[21]測(cè)定，可溶性糖含量用蒽酮比色法[19]測(cè)定，丙二醛含量用硫代巴比妥酸顯色法[19]測(cè)定，每處理重復(fù)3次測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.5進(jìn)行處理，用one-way ANOVA單因素方差分析及多重比較(LSD)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異顯著水平取α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根可以增加番茄地上生物量、根干質(zhì)量、株高和莖周長(zhǎng)，且各指標(biāo)的增加程度總體上與S960濃度有正相關(guān)關(guān)系，也可使番茄枯萎比例降低，且該指標(biāo)與S960濃度總體上呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(表1)。可見(jiàn)多粘類(lèi)芽孢桿菌S960不僅對(duì)番茄生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且對(duì)番茄枯萎病有一定的防治效果。

表1 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

數(shù)值表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一列不同的字母表示處理間差異顯著(P<5%，LSD法比較)，n=5

Data shown as mean ± standard deviation,different letters in the same column indicate significantdifferences between treatments (P<5%,LSD compare),n=5

2.2 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉綠素含量的影響

不同的字母表示處理間差異顯著(P<5%)，LSD比較，n=3Different letters indicate significantdifferences between treatments (P<5%,LSD compare),n=3圖1 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of Paenibacillus polymyxa S960 on the chlorophyll content of tomato

植物葉綠素a/b的比值含量高低是對(duì)逆境適應(yīng)的一種表現(xiàn)，葉綠素a/b的值降低意味著類(lèi)囊體膜堆疊程度的降低，進(jìn)而抑制了植物對(duì)光量子的有效吸收、傳遞和利用，使激發(fā)能不能迅速到達(dá)可利用的位置，從而降低光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的有效速率[22]。多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根可以顯著(P<0.05)提高番茄葉綠素a含量，但未顯著(P>0.05)影響番茄葉綠素b含量，多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根使葉綠素a/b的比值升高(圖1)。

2.3 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉片氣體交換常數(shù)的影響

氣孔是植物葉片與外界進(jìn)行氣體交換的通道，其開(kāi)度的大小對(duì)植物水分的吸收和CO2的同化有著重要的影響作用。一般隨著氣孔開(kāi)度的減小，氣孔阻力增加，蒸騰速率減小，CO2進(jìn)入葉片受阻，光合速率下降[22-23]。隨著多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根菌液濃度升高，番茄葉片PN、Ci，gs、E等指標(biāo)都先升高后又降低，且在10倍稀釋液(T3)達(dá)最高值(表2)。一定濃度的多粘類(lèi)芽孢桿菌S960菌液灌根，提高了番茄氣孔開(kāi)度，使其胞間CO2濃度升高，其蒸騰速率也升高，但凈光合速率也升高，這有利于番茄植株生物量積累，有利于植株生長(zhǎng)(表2)。

表2 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄氣體交換常數(shù)的影響

不同的字母表示處理間差異顯著(P<5%)，LSD法比較，n=10

Different letters indicate significant differences between treatments (P<5%,LSD compare),n=10

2.4 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉片熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

圖2 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉片熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Fig.2 Effect of Paenibacillus polymyxa S960 on the Chl a fluorescence of tomato

PIabs(光合性能指數(shù))比Fv/Fm(最大PSⅡ的光能轉(zhuǎn)換效率)能更靈敏地反映光合機(jī)構(gòu)的變化[24]。用10倍稀釋(T3)多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根后，番茄葉片的Fv/Fm未明顯變化，而PIabs升高(圖2)，這說(shuō)明用多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根，可以提高番茄葉片光合同化作用。ABS/RC(單位反應(yīng)中心吸收的光能)、TR0/RC(單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量)、ET0/RC(單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量)、DI0/RC(單位反應(yīng)中心耗散的能量)、φP0(最大光化學(xué)效率)、ψE0(反應(yīng)中心捕獲的激子中用來(lái)推動(dòng)電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其它電子受體的激子占用來(lái)推動(dòng)QA還原激子的比率)、φE0(用于電子傳遞的量子產(chǎn)額)、DFabs(以吸收光能為基礎(chǔ)的推動(dòng)力)等指標(biāo)均未發(fā)生明顯變化(圖2)。

2.5 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉片丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

丙二醛含量可指示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，可溶性糖參與環(huán)境脅迫應(yīng)答和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可溶性蛋白含量的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。各處理與對(duì)照(CK)比較，多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量均無(wú)顯著(P>0.05)影響，但是丙二醛含量顯著(P<0.05)降低(表3)。

表3 多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄葉片丙二醛、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

數(shù)值表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一列不同的字母表示處理間差異顯著(P<5%，LSD法比較)，n=3

Data shown as mean ± standard deviation,different letters in the same column indicate significantdifferences between treatments (P<5%,LSD compare),n=3

3 討論與結(jié)論

多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)是芽孢桿菌科(Bacillaceae)類(lèi)芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在劃入類(lèi)芽孢桿菌屬之前又稱(chēng)Bacilluspolymyxa[25]。一些生防菌，同時(shí)具有防病促生作用[26-28]。多粘芽孢桿菌中某些菌株也是重要的植物生防細(xì)菌和植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，植物根際促生菌通過(guò)定殖于植物根系，優(yōu)先占領(lǐng)根際，可產(chǎn)生生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，也可通過(guò)對(duì)植物病菌的抑制，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，而且PGPR還可產(chǎn)鐵載體等引起促生效果[29]。植物根際促生并非單純的PGPR的促生作用，而是與植物、根際微生物以及土壤等相互協(xié)同發(fā)揮作用[29]。多粘類(lèi)芽孢桿菌能分泌大量的活性物質(zhì)，對(duì)許多細(xì)菌和真菌有抑菌活性，能提高植物的抗病能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量[13,16]。其還可以通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng))、對(duì)病害因素的解毒以及產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物達(dá)到抑制、殺死或者溶解病原的作用[30-31]。本研究結(jié)果(表1)與前述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[26-28,30-31]一致，即多粘類(lèi)芽孢桿菌S960具有防病促生作用。

植物的光合速率、蒸騰速率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量、葉片可溶性蛋白、葉片可溶性糖等指標(biāo)，直接或間接影響或表征作物的生長(zhǎng)與生理過(guò)程。植物葉片中的光合色素參與光合作用過(guò)程中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換，光合色素含量直接影響植物光合能力，其中葉綠素與光合作用的關(guān)系最為密切，尤其是葉綠素a[21]。有研究表明：植物發(fā)生病害后葉片可溶性糖含量降低，可溶性蛋白含量升高，葉綠素含量降低，抑制葉片光合作用，一定程度上降低病害葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)值和黃酮類(lèi)化合物含量，從而降低葉片的品質(zhì)，危害植物的生長(zhǎng)[32]。葉綠素的合成受多種環(huán)境因素的影響，本研究結(jié)果(圖1)說(shuō)明在最適濃度下，多粘類(lèi)芽孢桿菌S960促進(jìn)了番茄光合機(jī)構(gòu)的發(fā)育，引起生理機(jī)能的提高[22]。多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根可能會(huì)提高番茄將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的有效速率。所以，多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根，能提高番茄葉片凈光合速率(表2)，利于番茄植株生物量積累(表1)。本研究結(jié)果(表3)還說(shuō)明多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根，可緩解番茄植株受病害脅迫下的細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，起到保護(hù)植株的作用。

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在測(cè)定葉片光合作用過(guò)程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨(dú)特的作用，與“表觀性”的氣體交換指標(biāo)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)更具有反映“內(nèi)在性”特點(diǎn)，因此，該技術(shù)被稱(chēng)為測(cè)定葉片光合功能的快速、無(wú)損傷探針[33]。Handy-PEA對(duì)植物受環(huán)境脅迫或“負(fù)面”影響的葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)較敏感，可以進(jìn)行快速測(cè)定[24]。本研究應(yīng)用Handy-PEA對(duì)番茄葉片熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)葉綠素含量較高和光合速率較高的處理組(T3)與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果(圖2)表明：多粘類(lèi)芽孢桿菌S960對(duì)番茄Fv/Fm、ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC、DI0/RC、φP0、ψE0、φE0、DFabs等指標(biāo)均沒(méi)有較明顯的影響，但是PIabs明顯提高。這在葉綠素a熒光動(dòng)力學(xué)水平進(jìn)一步驗(yàn)證了多粘類(lèi)芽孢桿菌S960能促進(jìn)番茄葉片光合速率，從而促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，同時(shí)也驗(yàn)證了PIabs指標(biāo)更敏感，可以更直接反應(yīng)植物光合速率隨環(huán)境因素變化的結(jié)論[23]。

另一方面，當(dāng)外界環(huán)境條件變化時(shí)，植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒獾淖兓梢栽谝欢ǔ潭壬戏从抄h(huán)境因子對(duì)植物的影響，逆境脅迫如缺鐵或錳饑餓、高溫、低溫、鹽脅迫及干旱脅迫等都能直接或間接地影響植物PSⅡ的功能[24]。但是多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根，促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，盡管經(jīng)多粘類(lèi)芽孢桿菌S960促進(jìn)作用，番茄葉片葉綠素a含量、凈光合速率都有顯著升高(表1、圖1和表2)，經(jīng)多粘類(lèi)芽孢桿菌S960處理后的番茄葉片的葉綠素a熒光參數(shù)各指標(biāo)均未顯著(P>0.05)高于對(duì)照組。這可能說(shuō)明大多數(shù)熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)不適合應(yīng)用在植物營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的領(lǐng)域。

多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根，可提高番茄葉片葉綠素含量，提高其凈光合速率，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)防治枯萎病有一定效果。多粘類(lèi)芽孢桿菌S960灌根，最適稀釋倍數(shù)為10倍(3.55×107cfu/mL)。