陸吉虎,張雪花,梅 梅,侯繼波,唐應華*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術研究中心/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇南京210014；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009)

隨著禽類養(yǎng)殖集約化、規(guī)模化發(fā)展，疫病流行日趨復雜并使疫苗防控難度逐步加大。雞新城疫(ND)、傳染性支氣管炎(IB)、減蛋綜合征(EDS)和禽流感(AI)均是由病毒引起的雞的傳染病，在養(yǎng)雞業(yè)中比較常見和多發(fā)，嚴重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。目前生產(chǎn)中主要采用接種滅活的油乳劑聯(lián)苗進行防控。但是隨著疫苗的推廣使用，病原也在不斷發(fā)生變異，給防控工作帶來了一定的困難。免疫增強劑能提高動物機體免疫系統(tǒng)功能，增強機體免疫力，如PolyI:C[1]、CpG[2,3]、LPS[4]、脂多糖、囊素五肽(BP5)、神經(jīng)酰胺、咪喹莫特等多種動物天然免疫受體的激動劑在動物的免疫應答過程中都發(fā)揮著重要的作用。免疫增強劑MF59在人用流感疫苗中已經(jīng)使用多年[5]，Intervet公司的豬圓環(huán)病毒疫苗和繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中都使用了DiluvacForte 佐劑[6]，Seppic公司的口蹄疫疫苗和新城疫疫苗分別添加使用了ISA206和ISA70佐劑[7]。

本試驗室已經(jīng)篩選獲得可與疫苗配伍使用的系列復方免疫增強劑，并對該增強劑對禽流感疫苗以及禽用二聯(lián)疫苗的免疫增強效果進行了評價[8-10]，本研究主要評價該免疫增強劑對禽用三聯(lián)或四聯(lián)滅活疫苗在海蘭褐殼蛋雞或羅曼蛋雞上的免疫增強效果，擴大該免疫增強劑的適用范圍。

1 材料與方法

1.1 疫苗、試驗雞及檢測抗原等材料

雞新城疫-傳染性支氣管炎-減蛋綜合征-禽流感(H9亞型)四聯(lián)油乳劑滅活疫苗(La Sota株+M41株+AV127株+HL株)(以下簡稱新-支-減-流四聯(lián)疫苗或四聯(lián)疫苗)，雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感(H9亞型)三聯(lián)油乳劑滅活疫苗(La Sota株+M41株+HL株)(以下簡稱新-支-流三聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗)，均為市售商品化疫苗。1日齡海蘭褐殼蛋雞和羅曼蛋雞均購自江蘇海安某孵化場，普通環(huán)境中飼養(yǎng)。雞新城疫、禽流感(H9亞型)和減蛋綜合征檢測抗原均購自哈爾濱維科生物技術公司，傳染性支氣管炎(M41株)檢測抗原購自荷蘭GD公司。雞新城疫F48E8株、禽流感(H9亞型)SD01株均為本實驗室保存。ND、IB、EDS、AI(H9)陽性、陰性血清分別購自哈爾濱國生生物科技和哈爾濱威科生物技術公司。

1.2 含VA5免疫增強劑疫苗的配制

VA5免疫增強劑(以下簡稱VA5)為本實驗室配制[8-9]。先將VA5與白油等按比例混合并充分乳化，然后與四聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗按體積比為1∶9混勻即為含VA5免疫增強劑的疫苗。

1.3 VA5對四聯(lián)疫苗的免疫效力增強試驗

1.3.1 海蘭褐殼蛋雞免疫含VA5的四聯(lián)疫苗試驗 海蘭褐殼蛋雞飼養(yǎng)至10日齡分為3組(35只/組)，第1組免疫四聯(lián)疫苗，第2組免疫含VA5的四聯(lián)疫苗，第3組為生理鹽水對照組。頸背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第1、第2和第3周每組隨機抽取5只雞用PBS緩沖液(10 mL/只)沖洗喉氣管，收集沖洗液；免疫后第2、第3和第4周每組隨機抽取20只雞采集翅靜脈血并分離血清。分別檢測上述沖洗液和血清針對新城疫(ND)、傳支(IB)(M41株)、減蛋綜合征(EDS)和禽流感(AI)(H9亞型)的血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)抗體效價(nlog2)(參照GB/T 16550-2008，新城疫診斷技術)，統(tǒng)計各組效價的幾何平均值(Geometric mean titer，GMT)。

上述海蘭褐殼蛋雞免疫4周后分成2群，第1群(15只/組)用雞新城疫F48E8株強毒肌肉注射0.2 mL/只(含1.0×105.0EID50)(egg infectious dose，EID50雞胚半數(shù)感染劑量)，觀察14 d，記錄雞發(fā)病死亡情況，統(tǒng)計攻毒保護率[(攻毒總雞數(shù)-發(fā)病或死亡總數(shù))/攻毒總雞數(shù)×100]；第2群(15只/組)，以禽流感(H9亞型)SD01株(1.0×107.0EID50)進行滴鼻攻毒，攻毒后的第1、第3、第5和第7天采集試驗雞的喉氣管、泄殖腔棉拭子。取每只雞的2個拭子混合浸出液上清0.1 mL接種10日齡SPF雞胚進行病毒分離，判定陽性率[10]。

1.3.2 羅曼蛋雞免疫含VA5的四聯(lián)疫苗試驗 羅曼蛋雞飼養(yǎng)至10日齡時分為3組(25只/組)，分別免疫四聯(lián)疫苗、含VA5的四聯(lián)疫苗和生理鹽水。頸背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第2、第3和第4周每組隨機抽取20只雞采集翅靜脈血并分離血清，檢測針對ND、IB、EDS、AI(H9亞型)的HI抗體效價。

1.4 VA5對三聯(lián)疫苗的免疫效力增強試驗

選擇海蘭褐殼蛋雞的母源抗體(針對ND、IB、AI(H9亞型))HI效價≤2log2時進行免疫。試驗雞分為3組，每組20只。第1組免疫三聯(lián)疫苗，第2組免疫含VA5的三聯(lián)疫苗，第3組為生理鹽水對照組。頸背部皮下注射，0.3 mL/只。免疫后第2、3、4周采集雞翅靜脈血分離血清，檢測針對ND、IB、AI(H9亞型)的HI抗體效價，統(tǒng)計各組效價的幾何平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 VA5免疫增強劑提高新-支-減-流四聯(lián)疫苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力

海蘭褐殼蛋雞免疫四聯(lián)苗后，第2、第3和第4周含VA5免疫增強劑組血清針對雞新城疫抗原的HI抗體效價均高于常規(guī)疫苗組，且第3、第4周HI抗體效價與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖1A)?？梢钥闯?，VA5可提高四聯(lián)疫苗對ND的HI抗體效價。

圖1 四聯(lián)苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力Fig.1 Efficacy of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

用雞傳染性支氣管炎抗原檢測血清HI抗體效價。結(jié)果顯示，免疫后第2、第3和第4周含VA5免疫增強劑組血清HI抗體效價均高于常規(guī)疫苗組，且第3、第4周血清HI抗體效價與常規(guī)疫苗組相比，差異顯著(P<0.05)(圖1B)?？梢钥闯?，VA5可提高四聯(lián)疫苗對IB的HI抗體效價。

用雞減蛋綜合征抗原檢測血清HI抗體效價。結(jié)果顯示，免疫后第2、第3和第4周含VA5免疫增強劑組血清HI抗體效價均高于常規(guī)疫苗組。且第3、第4周血清效價與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖1C)?？梢钥闯?，VA5可提高四聯(lián)疫苗對EDS的HI抗體效價。

用H9亞型禽流感抗原檢測血清HI抗體效價，免疫后第2周含VA5免疫增強劑組的血清HI抗體效價高于7log2，常規(guī)疫苗組第3周的血清HI抗體效價達到7log2以上。含免疫增強劑免疫組第3、第4周血清HI抗體效價與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖1D)?？梢钥闯?，VA5可提高四聯(lián)疫苗對H9的HI抗體效價。

用新城疫、傳支(M41株)、減蛋綜合征和禽流感(H9亞型)抗原分別檢測免疫后雞喉氣管沖洗液的HI效價，結(jié)果顯示免疫后第1、第2和第3周含VA5免疫增強劑組粘膜HI抗體效價均高于常規(guī)疫苗組，且第2、第3周含VA5免疫組針對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的粘膜HI抗體效價與常規(guī)苗組相比均差異極顯著(P<0.01)(圖2A、2B、2C、2D)?？梢钥闯?，VA5可提高四聯(lián)疫苗對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的粘膜HI抗體效價。

圖2 免疫四聯(lián)疫苗的海蘭褐殼蛋雞的粘膜抗體效價Fig.2 Mucosal Antibody titers of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

2.2 VA5免疫增強劑提高禽用新-支-減-流四聯(lián)疫苗對NDV和H9亞型AIV的攻毒保護力

免疫4周后以雞新城疫F48E8株強毒肌肉注射(1.0×105.0EID50)攻毒，結(jié)果顯示生理鹽水對照組全部死亡，四聯(lián)疫苗免疫組有2只雞出現(xiàn)精神不振、雞冠發(fā)紫等發(fā)病癥狀，保護率為87%(13/15)，含VA5的四聯(lián)疫苗免疫組無發(fā)病和死亡，保護率為100%(15/15)(表1)。由此可見，VA5免疫增強劑可以提高四聯(lián)疫苗對雞新城疫F48E8株的攻毒保護力。

以禽流感(H9亞型)SD01株進行滴鼻攻毒，檢測雞喉氣管和泄殖腔棉拭子樣品。含VA5免疫增強劑的試驗組均未檢測到病毒，而四聯(lián)苗免疫組在攻毒后第5天仍有2只雞檢測到病毒(2/15)，空白對照組在第7天有5只雞可以檢測到病毒(5/15)(表1)。由此可見，VA5可以提高四聯(lián)疫苗對禽流感(H9亞型)病毒的攻毒保護。

表1 蛋雞免疫四聯(lián)疫苗后NDV(IBV/ AIV)的攻毒保護率

dpc，攻毒后天數(shù)

dpc,days post challenge

2.3 VA5免疫增強劑提高禽用新-支-減-流四聯(lián)疫苗對羅曼蛋雞的免疫效力

分別用ND、IB、EDS、AI(H9亞型)的檢測抗原檢測羅曼蛋雞免疫四聯(lián)苗后第2周、第3周和第4周的血清，結(jié)果顯示含VA5免疫增強劑組免疫后第3周、第4周血清針對ND、IB、EDS、AI(H9亞型)的HI抗體效價均高于四聯(lián)疫苗免疫組并達到差異顯著水平(P<0.05)(圖3A、3B、3C、3D)?？梢钥闯觯琕A5可提高四聯(lián)疫苗對羅曼蛋雞的免疫效力。

圖3 四聯(lián)疫苗對羅曼蛋雞的免疫效力Fig.3 Efficacy of inactivated tetravalent vaccine (ND-IB-EDS-H9) in Lohmann laying hen breeds

2.4 VA5免疫增強劑提高新-支-流三聯(lián)疫苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力

海蘭褐殼蛋雞免疫三聯(lián)疫苗后，含VA5免疫增強劑組第2、3、4周針對雞新城疫抗原的血清HI抗體效價均高于常規(guī)疫苗組，且第3周和第4周血清效價與常規(guī)疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)(圖4A)。VA5提高三聯(lián)疫苗在海蘭褐蛋雞上對ND的HI抗體效價。

免疫后第2、3、4周含VA5免疫增強劑組血清針對雞傳染性支氣管炎抗原的HI抗體效價均高于三聯(lián)疫苗組。且VA5免疫增強劑組第4周血清效價與三聯(lián)疫苗組相比，差異顯著(P<0.05)(圖4B)。VA5能提高三聯(lián)疫苗在海蘭褐蛋雞上對IB的HI抗體效價。

免疫后第2周含VA5免疫增強劑組的血清針對H9的HI抗體效價高于三聯(lián)疫苗組且達7log2以上。含VA5免疫組第3、4周血清HI抗體效價與三聯(lián)疫苗組相比，均差異極顯著(P<0.01)(圖4C)。VA5 提高三聯(lián)苗在海蘭褐蛋雞上對AI(H9亞型)的HI抗體效價。

圖4 三聯(lián)疫苗對海蘭褐殼蛋雞的免疫效力Fig.4 Efficacy of inactivated trivalent vaccine (ND-IB-H9) in Hy-line brown laying hen breeds

3 討論

VA5免疫增強劑包含咪喹莫特、PolyI:C、神經(jīng)酰胺、胞壁酰二肽(MDP)等多種模式識別受體激動劑成分，并且不同單組分激動劑之間具有一定的協(xié)同效應，參與雞體內(nèi)的體液免疫和細胞免疫應答[11]，可以提高針對禽流感(H5 /H9亞型)的HI抗體效價、提高攻毒保護率并延長有效抗體持續(xù)期[8-9]；在新城疫-傳染性法氏囊和新城疫-禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗中添加VA5同樣可以提高該二聯(lián)苗對雞的免疫效力[10]。

生產(chǎn)中為了減少免疫應激，降低免疫成本并提高養(yǎng)殖綜合效益，多聯(lián)疫苗的使用將會逐步增多。本試驗從體液免疫和攻毒保護率2個方面比較了含免疫增強劑的禽用三/四聯(lián)滅活苗與常規(guī)疫苗對蛋雞的免疫效果。VA5免疫增強劑與新-支-減-流四聯(lián)疫苗或新-支-流三聯(lián)疫苗共同免疫海蘭褐殼蛋雞以及VA5免疫增強劑與新-支-減-流四聯(lián)疫苗共同免疫羅曼蛋雞后能明顯提升針對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的血清HI抗體滴度，且第3和4周血清抗體滴度與常規(guī)疫苗組相比差異均顯著(P<0.05)。該結(jié)果與在禽流感(H9或H5亞型)滅活疫苗、禽用二聯(lián)滅活疫苗(新城疫-法氏囊二聯(lián)滅活疫苗和新城疫-禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗)中添加VA5免疫增強劑的免疫增強效果一致[8-11]。含VA5免疫增強劑組針對ND、IB、EDS和AI(H9亞型)的粘膜HI抗體效價也遠高于不添加VA5的免疫對照組。這應該是VA5免疫增強劑中的咪喹莫特、PolyI:C等激動劑成分與巨噬細胞、樹突狀細胞等細胞表面的TLRs等受體結(jié)合后激活細胞，增強了機體的免疫應答[1,11-13]，從而誘導產(chǎn)生更高滴度的抗病毒抗體。毛光明等[14]發(fā)現(xiàn)在免疫新城疫疫苗前后同時注射PolyI:C可以明顯提高血清中抗新城疫病毒抗體；Zhang等[15]把PolyI:C與PRRS滅活疫苗共同免疫動物也誘導產(chǎn)生高滴度的血清抗體。VA5中咪喹莫特、PolyI:C等不同單組分激動劑之間具有協(xié)同效應[11]，因此在疫苗中添加VA5較單一使用某種激動劑具有更好的免疫增強效果。另外VA5免疫增強劑也能夠提高雞外周血淋巴細胞增值，提高CD4+、CD8+T淋巴細胞的比例，并誘導IL-4和IFN-γ細胞因子分泌[11,16-17]，從而增強了機體的抗病毒感染的能力。因此在本試驗中對免疫雞用雞新城疫強毒攻擊，含VA5免疫增強劑組獲得了100%的保護；用禽流感(H9亞型)SD01株攻毒后檢測喉氣管和泄殖腔棉拭子，含VA5免疫增強劑組均未檢測到病毒，而四聯(lián)苗免疫組在攻毒后第5天仍有雞能檢測到病毒。

以上結(jié)果表明，含VA5免疫增強劑的新-支-減-流四聯(lián)疫苗(或新-支-流三聯(lián)疫苗)免疫后比常規(guī)新-支-減-流四聯(lián)疫苗(或新-支-流三聯(lián)疫苗)能夠使機體提前產(chǎn)生抗體且抗體效價高從而縮短免疫后保護空白期，并提高了攻毒保護率。VA5免疫增強劑不僅能夠提高禽流感單苗、禽用新法二聯(lián)苗和新流二聯(lián)苗的免疫效力，對禽用新-支-減-流四聯(lián)疫苗(或新-支-流三聯(lián)疫苗)也具有同樣的免疫增強作用，具有廣闊的應用前景。