王桂峰　魏學(xué)文　王琰　宋煥

摘要： SRAP是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，分別利用SRAP技術(shù)和田間種植鑒定方法對對魯墾棉33號、仁和39號、魯棉研18號、中植棉2號、魯棉研36號共5個棉花品種進行純度的鑒定，結(jié)果表明：SRAP鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果的一致性較好，利用SRAP標記進行種子純度鑒定，替代田間種植鑒定，操作簡便，鑒定快速經(jīng)濟高效，同時可以克服田間種植鑒定周期長、易受環(huán)境影響等缺點。

關(guān)鍵詞：棉花種子；純度；檢驗；SRAP

中圖分類號：S562.091 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3143（2018）04-0002-05

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2018.04.001

0 引言

種子純度，作為評價農(nóng)作物種子質(zhì)量的最重要指標之一，只有達到相關(guān)規(guī)定的要求，才能真正發(fā)揮品種在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆等方面的優(yōu)良特性。檢驗農(nóng)作物品種種子純度的方法主要包括大田形態(tài)鑒定、生化標記鑒定和分子標記鑒定等三種方法。其中，大田形態(tài)標記鑒定所需周期長，存在誤差大，且對性狀差異小的品種鑒定難度高；生化標記鑒定則受制于組織或器官特異性，存在較大的局限性。棉花種子純度鑒定技術(shù)是業(yè)界的一大難題[1-5]。分子標記技術(shù)的發(fā)展，為品種鑒定提供了新的途徑。多種分子標記方法已開始用于品種純度和真?zhèn)蔚臋z驗，也為棉花種子純度檢驗提供了理論和可行方法。為此，項目組引進了相關(guān)序列擴增多態(tài)性（Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP）技術(shù)，開展棉花種子純度鑒定，為保證棉種質(zhì)量提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

SRAP是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，通過設(shè)計一對獨特的引物，對基因的開放閱讀框（Open reading frames，ORFs）的特定區(qū)域進行擴增，該技術(shù)由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li等于2001年提出[6]。上游引物（Forward primer）長17bp，包括5?端14bp的核心序列和3?端3bp選擇性堿基，其中核心序列前10bp為填充序列，無任何特異組成，后接“CCGG”序列特異結(jié)合G、C含量豐富的外顯子；下游引物（Reverse primer）長18bp，包括5?端15bp的核心序列和3?端3個選擇堿基，其中核心序列前11bp為填充序列，接著是“AATT”序列，特異結(jié)合A、T含量豐富的啟動子和內(nèi)含子。由于不同個體以及物種的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列變異很大，利用該引物對外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域和啟動子區(qū)域進行特異擴增，從而產(chǎn)生多態(tài)性。

SRAP技術(shù)的引物具有簡便、穩(wěn)定、高效、產(chǎn)率高、易測序、便于克隆目標片段等特點，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、煙草、花生、蘿卜等多種作物的遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、重要性狀的標記以及相關(guān)基因的定位克隆等方面[3，5，7-11]。

本研究從實用的目的出發(fā)，利用SRAP技術(shù)對棉花品種進行鑒定和種子純度分析，同時參考田間鑒定結(jié)果，為棉花種子純度鑒定提供一個實用、快速、準確、可行的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料與取樣方法

試驗選用山東省棉花原原種場保存的不同種質(zhì)資源RM0001～RM0027及繁育較多的魯墾棉33號、仁和39號、魯棉研18號、中植棉2號及魯棉研36號等品種為實驗材料。每個品種選取單株的幼葉，液氮速凍，-80℃保存，用于DNA提取。

1.2 DNA提取與PCR擴增

利用CTAB法提取棉花DNA。本實驗所有SRAP引物（表1）按照Li等提出的原則設(shè)計，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于PCR的Taq酶購自TaKaRa公司。按照試劑盒說明書配制20μlPCR擴增體系，PCR擴增在LabCycler 48（SensoQuest GmbH， G?ttingen， Germany）PCR儀上進行，程序為：94℃變性5 min；94℃變性60 s，35℃退火60 s，72℃延伸60 s，共5個循環(huán)；94℃變性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳系統(tǒng)采用北京六一電泳儀，擴增產(chǎn)物經(jīng)6%的非變性聚丙烯胺凝膠電泳檢測，180V恒壓電泳90 min。

1.4 銀染檢測

電泳結(jié)束后，用蒸餾水稍微沖洗凝膠，按以下方法銀染： 10%（V/V）乙醇和0.5%（V/V）冰乙酸固定15 min，；0.2% AgNO3溶液銀染20 min；蒸餾水漂洗5s左右，0.002%（wv）硫代硫酸鈉的水溶液漂洗2 min；用1% NaOH和0.5%甲醛溶液顯色至譜帶清晰；0.75%Na2CO3溶液終止顯色。之后自來水反復(fù)漂洗幾次，減少甲醛殘留。

1.5 SRAP引物的篩選

用棉花品種RM0001、RM002，對81對引物進行篩選，從而篩選出可用于鑒定不同棉花品種種子純度的多態(tài)性引物。

1.6 遺傳多態(tài)性分析

用篩選出的引物對RM0001～RM0027以及魯墾棉33、仁和39、魯棉研18號、中植棉2及魯棉研36號進行PCR擴增，并記錄擴增情況，按下列公式對各對引物的多態(tài)性信息進行統(tǒng)計：引物的多態(tài)性比率（%）=多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù)×100%。

1.7 田間種植鑒定分析

分別于魯墾棉33號、仁和39號、魯棉研18號、中植棉2及魯棉研36號共5個品種的繁育田內(nèi)隨機選取100株，根據(jù)個品種的典型性狀，對品種植株和雜株進行區(qū)分，從而進行田間種植鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物的篩選

利用上文優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系，以棉花品種RM0001、RM002篩選81對SRAP引物組合。篩選結(jié)果表明，79對SRAP引物擴增出條帶，并從79對引物中選擇23對條帶清晰、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的SRAP引物，對棉花材料進行指紋圖譜檢測，結(jié)果見圖1。

2.2 遺傳多態(tài)性分析

利用23對SRAP引物，以32份棉花材料的DNA為模板進行PCR擴增，不同引物對在不同棉花品種中的擴增結(jié)果見表2。結(jié)果表明， 152個多態(tài)性位點被檢測到，多態(tài)性位點比例為73.08%，平均每對引物6.9個多態(tài)性位點。其中， ME1-EM6和ME3-EM8引物檢測到的多態(tài)性位點最多，各為10個；ME5-EM4引物檢測到的多態(tài)性位點最少，為2個。

由于ME1-EM8與ME6-EM6引物對多態(tài)性較高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，能夠有效地區(qū)分5個棉花品種。因此，本實驗采用這2對引物對棉花品種種子純度進行鑒定分析。

2.3 5種棉花品種純度鑒定

利用ME1-EM8與ME6-EM6兩個引物組合對5種棉花品種進行SRAP純度鑒定，結(jié)果表明，5個種棉花品種的純度分別為95.311%，97.873%，95.102%，94.799%和95.123%。SRAP純度鑒定結(jié)果與田間種植純度鑒定結(jié)果符合率分別為96.27%，98.86%，98.04%，98.75%和98.06%（表3）。

3 討論

3.1 關(guān)于SRAP擴增譜帶的取舍

SRAP擴增產(chǎn)物在基因組中的拷貝數(shù)，以及引物及模板的同源性程度均與SRAP擴增條帶的強弱有關(guān)。所以，SRAP引物作為DNA多態(tài)性標記重要的取舍標準是重復(fù)性，同時也要兼顧PCR擴增條帶的強弱程度。因為如果某一樣品模板DNA質(zhì)量較差，則會造成該樣品的PCR擴增條帶較弱；如果SRAP引物與模板DNA的匹配程度低，尤其當(dāng)退火溫度升高時，可能會多擴增的穩(wěn)定性造成影響，從而造成某一個體的大部分帶與其它個體強度一致，但僅有一條或少數(shù)幾條條帶較弱的現(xiàn)象。所以，利用SRAP技術(shù)對一個擴增位點鑒定分析時，為了提高鑒定的穩(wěn)定性，需要進行全面的鑒定分析比較。即鑒定時應(yīng)進行多次重復(fù)，選取多態(tài)性好、穩(wěn)定性強的引物對，用于鑒定分析，同時選取穩(wěn)定性高的條帶進行統(tǒng)計記錄。

3.2 利用SRAP標記鑒定棉花品種種子純度的準確性與真實性的影響因素

理論上，SRAP技術(shù)是在分子水平上對基因型進行鑒定，其結(jié)果可靠、準確。本質(zhì)上，SRAP技術(shù)是PCR擴增反應(yīng)，因此從采集樣品、編號、提取DNA等過程均應(yīng)做到準確、一致而且無交叉污染，從而保證實驗的準確真實。再者，PCR反應(yīng)條件與PCR結(jié)果假陽性也是重要的影響因素，選擇高效的Taq酶和適宜的退火溫度，可以保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性。因此，應(yīng)選擇擴增條帶簡單、退火溫度影響不大或?qū)U增條件不敏感的SRAP引物進行PCR反應(yīng)。其次，由于影響PCR擴增反應(yīng)的因素較多，因此需要對不同鑒定材料以及不同品牌的PCR相關(guān)試劑進行優(yōu)化，確保PCR反應(yīng)體系和程序適宜，從而提高鑒定結(jié)果的準確和真實。最后，利用SRAP技術(shù)進行種子純度鑒定時，是對ORFs進行PCR擴增，所以鑒定時使用的引物對越多，鑒定結(jié)果的可靠性越高，但成本也隨之提高。綜上，利用SRAP技術(shù)進行種子純度鑒定時，選擇多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SRAP引物對，以便達到鑒定種子純度的目的。

3.3 利用SRAP標記鑒定棉花品種種子純度的可行性分析

通過對5種棉花純度的鑒定表明，SRAP鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果的一致性較好，因此，可以選擇SRAP標記進行種子鑒定，以替代田間種植鑒定，從而克服其鑒定周期長、易受環(huán)境影響等缺點。同時，作物品種種子純度鑒定，不僅要求簡便、快速、準確，還要考慮經(jīng)濟成本因素。在進行種子純度鑒定時，SRAP技術(shù)是通過獨特的引物設(shè)計對ORFs進行PCR擴增，只需改變引物3′端的3bp的選擇性堿基即可得到大量的引物對，且上游引物與下游引物可自由搭配，因此用少量的引物即可獲得多種引物組合，具備操作簡便，鑒定快速經(jīng)濟高效的特點。

參考文獻

[1] 張殿忠. 棉花種子生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量控制[J]. 中國農(nóng)業(yè)文摘-農(nóng)業(yè)工程，2017，29（02）：65.

[2] 黃殿成，王飛，劉建功，等. 種子企業(yè)應(yīng)用SSR分子標記鑒定棉花品種真實性和種子純度[J].中國種業(yè)，2015（10）：37-38.

[3] 李家梅. 利用ISSR分子標記技術(shù)鑒定棉花的品種真實性和純度[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[4] 張西嶺，王寶連，張海堂，等. 海南鑒定雜交棉種子純度價值性分析[J]. 中國棉花，2009，36（08）：18-19.

[5] 王俊芳. 基于SSR標記的棉種真實性和品種純度鑒定技術(shù)研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[6] 趙上娟，鐘金城，柴志欣，等. 西藏牦牛SRAP遺傳多樣性及分類進化研究[J]. 生物技術(shù)通報，2012（06）：77-82.

[7] 許春梅，柳景蘭，張作標. SRAP標記技術(shù)在種子純度鑒定中的研究進展[J]. 中國園藝文摘，2015，31（02）：36.

[8] 熊麗曼，王賢磊，高興旺，等. 應(yīng)用SRAP標記鑒定甜瓜種子純度[J]. 種子，2012，31（02）：9-12.

[9] 劉澤發(fā)，孫小武，董亞靜. SRAP標記鑒定西瓜種子純度方法研究[J]. 中國瓜菜，2009，22（01）：5-8.

[10] 王從彥，李曉慧，胡小麗，等. SRAP技術(shù)在西瓜種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008（05）：491-495.

[11]劉強，高新學(xué)，劉鐵山等.SRAP技術(shù)在水稻品種鑒定和純度檢測中的應(yīng)用研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（01）：26-28.