韓小東 張榮志 宋國琦 李瑋 李玉蓮 張淑娟 高潔 陳明麗 李根英

摘要：小麥抗赤霉病基因中，F(xiàn)hb1基因的抗性最強且最穩(wěn)定。為了解620份小麥品種（系）Fhb1區(qū)段內PFT（pore-forming toxin-like）基因不同等位變異的情況及其地理分布規(guī)律，我們采用基因擴增和KASP基因分型技術對其進行了鑒定。檢測結果表明，在這些小麥品種中，共存在3種基因型，即PFT-Ⅰ基因型（GT）、PFT-Ⅱ基因型（AC）和PFT-Ⅲ基因型（null），其頻率分別為10.65%、14.19%和75.16%，即只有約四分之一的小麥品種攜帶PFT基因。PFT-Ⅰ基因型主要分布在國內地方品種以及陜西、江蘇和山東等地的育成品種中；而PFT-Ⅱ基因型則主要分布在河北、河南和山東等地的育成品種中。PFT-Ⅰ是小麥抗赤霉病的必需基因型。因此，這些含PFT-Ⅰ基因型的小麥品種（系）可作為小麥抗赤霉病品種選育的基礎材料。

關鍵詞：小麥；赤霉??；Fhb1；PFT；KASP標記

中圖分類號：S512.103.53 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0001-06

Allelic Variation Distribution of Fusarium Head Blight Resistance

Gene Fhb1 in Wheat Germplasm

Han Xiaodong， Zhang Rongzhi， Song Guoqi， Li Wei，

Li Yulian， Zhang Shujuan， Gao Jie， Chen Mingli， Li Genying

（Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Wheat Biology & Genetic Improvement on North Yellow & Huai River Valley， Ministry of Agriculture/

National Engineering Laboratory for Wheat & Maize， Jinan 250100， China）

Abstract The QTL Fhb1 conferring stable Fusarium head blight（FHB） resistance contributes to the largest effect in wheat. To characterize the allelic variation and geographic distribution of PFT（pore-forming toxin-like） gene in the Fhb1 region of 620 wheat cultivars （lines）， we identified it by PCR amplification and KASP （Kompetitive Allele Specific PCR）. The results showed that there were three genotypes in these wheat varieties， including PFT-Ⅰ（GT）， PFT-Ⅱ（AC）and PFT-Ⅲ（null） genotypes with the frequency of 10.65%， 14.19% and 75.16%， respectively. That was， only about quarter of the tested cultivars carried the PFT gene. Most of the wheat varieties with PFT-Ⅰ genotype were derived from the landraces and breeding cultivars from Shaanxi， Jiangsu and Shandong Province， while the varieties with PFT-Ⅱ genotype were mostly derived from the breeding cultivars of Hebei， Henan and Shandong Province. The PFT-Ⅰ genotype was essential for the FHB resistance in wheat. Thus， these wheat cultivars （lines） with PFT-Ⅰ genotype could be used as the basic materials for wheat breeding with FHB resistance.

Keywords Wheat； Fusarium head blight； Fhb1； PFT； KASP marker

赤霉病嚴重降低小麥產(chǎn)量、影響谷粒品質，其產(chǎn)生的毒素危及人畜、影響食品安全等[1-3]。近幾年來，我國小麥赤霉病的發(fā)生區(qū)域有由長江中下游麥區(qū)和東北麥區(qū)向黃淮海麥區(qū)和北方麥區(qū)逐漸擴大的趨勢[4]。小麥赤霉病抗性分為抗初次侵染（Type Ⅰ）、抗擴展（Type Ⅱ）、抗赤霉素積累（Type Ⅲ）、抗籽粒侵染（Type Ⅳ）和抗減產(chǎn)（Type Ⅴ）五大類[5]。每一種抗性類型均受表型加性效應和數(shù)量性狀遺傳的多基因調控[6]。Type Ⅱ型較其他類型穩(wěn)定也易于鑒定[7]，從而成為研究最多的一種類型。

迄今為止，蘇麥3號是赤霉病抗性最強最穩(wěn)定的抗原之一[8]。在小麥抗赤霉病擴展基因中，3BS染色體上的主效QTL Fhb1基因的抗性最強且最穩(wěn)定[9-15]。Rawat等[16]通過蘇麥3號3BS染色體上的主效QTL Fhb1的精細定位，圖位克隆獲得了抗赤霉病擴展的基因PFT（pore-forming toxin-like）。PFT基因序列包含3 472個堿基，2個外顯子和1個內含子。其編碼區(qū)含1 437個堿基，編碼478個氨基酸，屬于嵌合凝集素類型蛋白。功能上可能與赤霉菌結合，抑制其生長，從而實現(xiàn)抗病。朱展望等[17]對229份小麥品種Fhb1區(qū)段內PFT、HC（HCBT-like defense response protein）和His基因的多樣性與赤霉病抗性的關系進行了分析，發(fā)現(xiàn)整個PFT基因缺失的小麥材料，即為PFT-Ⅲ基因型（null），如中國春。在攜帶PFT基因的小麥品種中，有兩個SNP位點的差異。第一個SNP（G/A）位點發(fā)生在第2 128位點，此位點的突變會造成mRNA的錯誤剪接。第二個SNP（T/C）位點，發(fā)生在第2 255位點。兩個SNP位點為GT基因型的被命名為PFT-Ⅰ基因型，如蘇麥3號。兩個SNP位點為AC基因型的被命名為PFT-Ⅱ基因型，如南大2 419。而且只有PFT-Ⅰ/His-Ⅰ為抗赤霉病單倍型。

近幾年來，KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）基因分型技術，因其成本低、通量高、精準度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點[18]，被廣泛用于檢測SNP分型及Indels位點[19，20]。前人對Fhb1區(qū)段內抗赤霉病基因的研究，主要通過分子標記進行常規(guī)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，所研究的小麥品種（系）主要來源于赤霉病多發(fā)的長江中下游麥區(qū)[17]。本研究結合基因擴增和KASP基因分型技術，對620份不同來源（主要包括黃淮海麥區(qū)和北方冬麥區(qū)）的小麥品種（系）進行了抗赤霉病基因型的鑒定，以期為當?shù)氐男←湷嗝共】剐愿牧继峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于PFT基因型鑒定的國內外小麥品種（系）共計620份，其中，國內品種（系）547份（含43份地方品種），國外品種（系）69份，來源不詳4份。國內品種（系）包括北方冬麥區(qū)：北京33份，寧夏3份，河北38份，陜西34份和山西13份；長江中下游麥區(qū)：江蘇9份；西南麥區(qū)：四川50份；黃淮海麥區(qū)：安徽19份，河南133份和山東165份；西北麥區(qū)：甘肅1份，新疆1份和青海4份；東北麥區(qū)：黑龍江1份。其中，江蘇省的蘇麥3號作為陽性對照。

1.2 試劑

2×TSINGKE Master Mix購置于青島擎科梓熙生物技術有限公司；2×KASP Master Mix購置于LGC集團；DNA提取試劑盒購置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 小麥基因組DNA提取

每份試驗材料取3粒種子，室溫下發(fā)芽后取其幼嫩葉，參照植物基因組DNA提取試劑盒說明，提取其基因組DNA。利用NANODROP2000儀器檢測DNA的濃度以及純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計

依據(jù)蘇麥3號主效QTL Fhb1區(qū)段（GenBank： KX907434.1）內PFT基因的序列，通過Primer Premier 5.0軟件設計PFT基因的特異擴增引物（青島擎科梓熙生物技術有限公司合成）和KASP 標記引物（基因集團上海貝晶生物技術有限公司合成），見表1。

1.5 PFT基因的擴增

以上述提取獲得的小麥基因組DNA為模板、PFT-F/PFT-R為引物進行PCR擴增，以篩選PFT-Ⅲ和非PFT-Ⅲ基因型的小麥品種。PCR反應采用15 μL體系：2×TSINGKE Master Mix 7.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應在Eppendorf系列PCR儀上進行，程序如下：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取8 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測帶型，以確定其基因型。

1.6 KASP反應

將用來鑒定PFT-Ⅰ和PFT-Ⅱ變異類型的KASP引物進行混合，共有2組引物，每一組混合引物都由兩條末端標簽序列不同的等位基因正向引物（100 μmol·L-1）各12 μL、一條共同的反向引物（100 μmol·L-1）30 μL和46 μL ddH2O組成。PCR反應采用5 μL體系：2×KASP Master Mix 2.5 μL，混合引物0.07 μL，DNA（10 ng·μL-1）2.0 μL，ddH2O 0.43 μL?？瞻讓φ眨∟TC）的DNA模板用ddH2O代替。PCR程序如下：94℃熱激活15 min；94℃變性20 s，61℃退火/延伸60 s，10個循環(huán)（每個循環(huán)降低0.7℃）；94℃變性20 s，55℃退火/延伸60 s，26個循環(huán)。反應結束后在酶標儀Pherastar上讀取熒光數(shù)據(jù)，并通過SNPviewer軟件生成基因分型圖。

2 結果與分析

2.1 小麥基因組DNA提取

用NANODROP2000儀器檢測出的DNA濃度均在500 ng·μL-1左右，A260/A280的OD值處于1.8～2.0之間?；蚪MDNA電泳結果如圖1所示，所提DNA條帶清晰無彌散，可用于下一步試驗。

2.2 PFT基因的擴增

為了篩選出PFT-Ⅲ和非PFT-Ⅲ基因型的小麥品種，根據(jù)PFT基因的序列設計特異引物，進行了普通PCR擴增。通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的帶型，結果如圖2所示：目的條帶為842 bp的為PFT-Ⅰ基因型或PFT-Ⅱ基因型；沒有目的條帶的為PFT-Ⅲ基因型。檢測結果顯示，466份小麥材料為PFT-Ⅲ，154份小麥材料為非PFT-Ⅲ。

2.3 小麥品種PFT基因型的KASP檢測

利用KASP標記引物通過基因分型技術鑒定PFT-Ⅰ和PFT-Ⅱ基因型的變異類型，結果如圖3所示。圖中每個圓點都代表著一個小麥品種，每組混合引物將154份小麥材料分為兩組，紅色圓點為HEX標簽序列，藍色圓點為FAM標簽序列，黑色圓點為空白對照。圖3A和圖3B為第一個SNP位點（G/A）的分型結果，紅色圓點代表PFT-Ⅱ基因型中的A∶A，有88份；藍色圓點代表PFT-Ⅰ基因型中的G∶G，有66份。圖3C和圖3D為第二個SNP（T/C）位點的分型結果，紅色圓點代表PFT-Ⅱ基因型中的C∶C，有88份；藍色圓點代表PFT-Ⅰ基因型的T∶T，有66份。綜合上述結果，PFT-Ⅰ基因型（GT型）的小麥品種共66份，PFT-Ⅱ基因型（AC型）的小麥品種共88份，未檢測到基因型為GC型和AT型的小麥品種。因此，共有66份小麥品種可能具有赤霉病的抗性。

2.4 不同基因型小麥品種資源的區(qū)域分布

參與試驗的620份小麥品種（系）中，通過PFT基因的PCR檢測發(fā)現(xiàn)PFT-Ⅲ基因型分布最多，約占所選材料的四分之三，而PFT-Ⅰ、PFT-Ⅱ基因型的分布頻率相當，分別為10.65%和14.19%（表2）。如圖4所示，在地方品種（50%以上的為PFT-Ⅰ基因型）、北方冬麥區(qū)的陜西、長江中下游冬麥區(qū)的江蘇和黃淮海冬麥區(qū)的山東和河北等地，含PFT-Ⅰ基因型的小麥品種（系）分布頻率較高；含PFT-Ⅱ基因型的小麥品種（系）則主要分布于北方冬麥區(qū)的河北、黃淮海冬麥區(qū)的河南和山東等地。國外小麥品種（系）中，大部分屬于PFT-Ⅲ基因型；日本品種（系）中，有2個屬于PFT-Ⅰ基因型；法國品種（系）中，有1個屬于PFT-Ⅰ基因型；意大利品種（系）中，有2個屬于PFT-Ⅰ基因型。

本研究還利用中國作物種質資源信息網(wǎng)查詢了部分已檢測出的PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）的赤霉病抗性（表3），發(fā)現(xiàn)PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）中，21份材料表現(xiàn)為感赤霉病，2份材料表現(xiàn)為中感赤霉病，其余抗性未知。

3 討論與結論

赤霉病表型鑒定受自然環(huán)境以及人的主觀判斷影響很大，不易被準確監(jiān)測。KASP檢測方法不僅上機試劑用量少、通量高，而且檢測精確度很高。本研究通過基因擴增結合KASP標記準確又快速地鑒定出了620份小麥品種（系）（主要包括黃淮海麥區(qū)和北方冬麥區(qū)）中的PFT基因型。這為當?shù)馗牧夹←湷嗝共】剐杂N過程中的親本選配以及后期高代品系的初篩提供了參考。

620份小麥品種（系）的PFT基因型鑒定結果表明，PFT-Ⅲ類型為小麥品種（系）的主要基因型（分布頻率為75.16%），這可能是與含有Fhb1區(qū)段的小麥品（種）系的農藝性狀差和產(chǎn)量低等不符合現(xiàn)代育種家的要求等因素有關[17]。中國作物種質資源信息網(wǎng)公布的部分已檢測出的PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）的赤霉病抗性發(fā)現(xiàn)，某些PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）感赤霉?。欢煺雇萚17]對229份小麥品種（主要包括長江中下游麥區(qū)）Fhb1區(qū)段內PFT、HC和His基因的多樣性與赤霉病抗性的關系進行了分析，其中PFT基因型分為PFT-Ⅰ、PFT-Ⅱ和PFT-Ⅲ三類，His基因型分為His-Ⅰ、His-Ⅱ和His-Ⅲ三類，但是只有PFT-Ⅰ/His-Ⅰ為抗赤霉病單倍型，這說明PFT-Ⅰ基因型雖然不能作為篩選抗赤霉病小麥品種（系）的最終標準，但可以作為初步篩選的方法。

本研究結果顯示PFT-Ⅰ基因型主要分布在中國北方冬麥區(qū)的河北和陜西、長江中下游冬麥區(qū)的江蘇、黃淮海冬麥區(qū)的山東以及國外的意大利和日本等地，而且50%以上的地方品種均為PFT-Ⅰ基因型。在國家農業(yè)科學數(shù)據(jù)共享中心作物科學數(shù)據(jù)分中心的小麥品種系譜數(shù)據(jù)庫中，通過查詢部分已檢測出的PFT-Ⅰ基因型小麥品種（系）的系譜，發(fā)現(xiàn)PFT-Ⅰ基因型可能來源有三種，一種是地方品種，比如涇陽60、三月黃、洋小麥、白齊麥等；一種是蘇麥3號或小偃6號的某一早代親本，比如陜253（77-31/小偃6號//陜229）；最后一種為美國碧玉麥，比如石家莊54（螞蚱麥/碧玉麥//早洋麥）、昌樂5號（濟南4號變異株）、濟南4號（螞蚱麥/碧玉麥//早洋麥），因為本研究已檢測螞蚱麥和早洋麥屬于PFT-Ⅲ基因型，而石家莊54為PFT-Ⅰ基因型，所以據(jù)此可推斷PFT-Ⅰ基因型可能確實來源于美國的碧玉麥，這與前人的研究結果相一致[21-23]。此外，法國、日本和意大利的小麥品種中也檢測到PFT-Ⅰ基因型的存在，預示PFT-Ⅰ基因型可能還有另外的來源。

總之，在今后的育種工作中，我們可以充分利用含PFT-Ⅰ基因型的小麥地方品種和栽培品種，從中選擇農藝性狀優(yōu)良的作為親本，來進行小麥抗赤霉病的品種改良和新種質資源的創(chuàng)制。

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